Диссертация (Создание новых комплексных ферментных препаратов грибных протеаз на основе штамма Penicillium canescens для эффективной конверсии белоксодержащего растительного сырья), страница 7

Этот фермент также называют аспергиллопепсин А(продуцент A. awamori), аспергиллопепсин F (A. foetidus), протеиназа В, проктазаВ (A. niger), аспергиллопептидаза А (A. saitoi). Аспергиллопепсин II (ЕС 3.4.23.18)не обладает молокосвертывающей активностью, гидролизует β-цепь инсулина.Из-за узкой специфичности не применяется в промышленности. Фермент такженазывают проктаза А или протеиназа А (продуцент A. niger var. macrosporus).Пенициллопепсин (ПЕП, ЕС 3.4.23.20), синтезируемый грибами родаPenicillium, обладает широкой субстратной специфичностью, по специфичностидействия аналогичен аспергиллопепсину I, предпочтительно катализируетгидролиз гидрофобных остатков в положении P1 и P1', кроме того расщепляет36связи Gly-Gly в β-цепи инсулина. ПЕП широко применяется для полученияпептидов, не образующих горечь 87, 88].Известны также ризопуспепсин (из Rhizopus sp.) и мукорпепсин (из M.pusillus, M.

miehei). Ферменты обладают молокосвертывающей активностью.Ризопуспепсин характеризуется широкой специфичностью действия, как и ПЕП;мукорпепсин по специфичности близок к ренину. Однако использование данныхферментов в промышленности ограничено требованиями безопасности [87].Щелочные сериновые протеазы широко распространены в природе иприсутствуютвопродуцируютбактерии,Flavobacterium,всехформахклеточнойвключаямицелиальныежизни.Bacillus,грибы,включаяСериновыеArthrobacter,Conidiobolus,протеазыStreptomyces,Aspergillus,Neurospora, дрожжи, в том числе S.

cerevisiae [89].Сериновые протеазы продуцируют грибы родов Aspergillus, Penicillium,Rhizopus, Paecylomices, Trichoderma, Cephalosporium и др. [9]. Хорошо изучены ишироко применяются сериновые протеазы мицелиальных грибов рода Aspergillus:A. niger, A. oryzae, A. fumigatus, A. clavatus [90, 91]. Щелочные протеазыаспергиллов проявляют высокую степень гомологии субтилизинам (29–44%).Наиболее подробно исследован оризин из A. oryzae (Alp), проведены работы поопределению его а.к. последовательности и клонированию гена. Протеазу Alpэкспрессировали в дрожжах S. cerevisiae и Zygosaccharomyces rouxii, однако,продуктивность рекомбинантных штаммов была ниже коммерчески приемлемогоуровня.

Сериновую протеазу A. oryzae также клонировали в метилотрофныедрожжи P. pastoris [92]. Были проведены исследования по клонированиютермостабильной щелочной протеазы B. stearothermophilus и P. pastoris [93].Известен штамм A. oryzae U1521, содержащий несколько копий гена щелочнойпротеазы Alp [94].Среди нейтральных эндопептидаз мицелиальных грибов наиболее частовстречается цинк-зависимая нейтральная металлопротеиназа [70].Среди грибных экзопептидаз наиболее распространена ЛАП. Коммерческиепрепараты ЛАП, получают из R. oryzae, A.

sojae и A. oryzae [23, 95]. Очищенный37фермент из A. sojae (ATCC 42249) наиболее активен при pH 9,0 и 70℃ [95].Супернатант КЖ A. oryzae шт. ATCC 20386 содержит ЛАП, активную при рН 9,5и 55°C [96].Ниже приведены свойства некоторых грибных протеаз (таблица 4).Таблица 4 – Свойства некоторых грибных протеаз [10]ПродуцентA. clavatusES1A. clavatusCCT2759A. fumigatusFresenius TKU003A. oryzaeATCC 20386A. sojaeATCC 42249A. sydowiA.

tamariiA. terreusBeauveria bassianaChrysosporiumkeratinophilum IMI338142ConidioboluscoronatusNCIM 1238Fusarium culmorumMw,кДаОптимумрНОптимум Т,ºСЛитература328,550[97]-9,540[38]1248,040[98]ЛАП569,555[96]ЛАП419,070[95]407,0–7,545[99]487,5–8,045–50[100]378,537[101]358.537[102]-8,040[103]6,89,745[104]28,78,3–9,650[105]388,0-[106]66БСА – 4,0-18БСА – 4,5-ФерментЩелочнаясериноваяпротеазаЩелочнаяпротеазаЩелочнаясериноваяпротеазаЩелочнаясериноваяпротеазаЩелочнаяпротеазаЩелочнаясериноваяпротеазаЩелочнаясериноваяпротеазаКератиназаЩелочнаясериноваяпротеазы BСериноваясубтилизинподобнаяпротеазаHumicolalanuginosa(Thermomyceslanuginosus)СериноваятиолзависимаяпротеазаN.

crassaКислая протеазаМеталлопротеазаM-238[107]ПродуцентФерментMw,кДаОптимумрНОптимум Т,ºСЛитератураPaecilomyceslilacinusСериноваятиолзависимаяпротеаза33,510,0–12,030–60[108]P. dupontiК1014Кислая протеаза41Казеин – 2,5Гемоглобин –3,0-[109]20,510,535[110]345,560[111]339,037–50[112]-6,5–8,037–45[113]-5,560[114]P. expansumR. oryzaeScedosporiumapiospermumScytalidiumthermophilumThermoascusaurantiacusЩелочнаяцистеиноваяпротеазаКислаяаспартатнаяпротеазаЩелочнаясериноваяпротеаза АСериноваятиолзависимаяпротеаза исериноваяпротеазаКислая протеаза1.4 Подходы к получению грибных рекомбинантных продуцентов1.4.1 Использование мицелиальных грибов для продукции рекомбинантныхбелковПолучение высокоактивных рекомбинантных штаммов с применениемметодовгеннойинженерииявляетсяоднимизосновныхнаправленийсовременной биотехнологии.

Преимущество генной инженерии по сравнению сметодами классической микробиологии состоит в (1) возможности получениямультиферментных комплексов с заданным соотношением компонентов, (2)меньших затратах времени для создания новых штаммов, (3) возможностиполучения продуцентов целевых коммерчески важных ферментов и (4)стабильной интеграции целевого гена(ов) в хромосому гриба [115].В настоящее время значительную долю коммерческих ФП и другихпродуктовпромышленнойбиотехнологии39производятсиспользованиемрекомбинантных штаммов мицелиальных грибов.

Экспрессионные системы наоснове грибов характеризуются более высоким уровнем секреции ферментов посравнению с бактериальными. Ранее широкому применению мицелиальныхгрибов для продукции гетерологичных белков препятствовала сложность инедостаточное понимание их физиологии по сравнению с бактериальнымиштаммами [115]. Однако в последние десятилетия был получен большой объеминформации о геномегрибных штаммов,что позволяет разрабатыватьэффективные системы экспрессии для создания промышленных рекомбинантныхштаммов. Был получен ряд грибных штаммов-реципиентов и разработаны методыих трансформации для повышения уровня синтеза целевых ферментов.

Наиболеечасто используют системы экспрессии на основе штаммов Aspergillus [116, 117] иTrichoderma [118, 119]. Также известно использование штаммов Neurospora crassaдля экспрессии гетерологичных генов с целью производства вакцин на основебелков и ферментов, и Myceliophthora thermophila (ранее Chrysosporiumlucknowense) в качестве реципиента для экспрессии ферментов [115, 120].При создании трансформационных систем основные требования к штаммуреципиенту заключаются в следующем: простой, масштабируемый процесс культивирования с использованиемнедорогих ферментационных сред; способность секретировать большое количество внеклеточного белка (неменее 10-15 г/л белка); способность к продуктивной секреции (экспрессии) целевого белка, т.е. кпродукции белка в активной форме, без дополнительных этапов активацииили модификации; простота экспериментального подхода трансформации, высокая частотатрансформации; стабильностьполучаемыхтрансформантовэкзогенной ДНК);40(интегративнаявстройка широкий диапазон используемых для экспрессии регуляторных элементов,простых и универсальных в применении; возможность использования дешевых селективных маркеров.Общая схема получения ФП с использованием трансформационных системна основе мицелиальных грибов, применяемая в области генной инженерии,представлена на рисунке 5 (по данным [11]).Амплификацияи клонированиецелевых геновТрансформацияв клетки E.coli.СеквенированиегенаВыделение ДНКЛабораторнаяферментацияв колбахПервичныйскринингтрансформантовс помощью ПЦРКотрансформация в штаммреципиентСкринингцелевых ибазовыхактивностейМасштабирование и получениеФПБиохимическийанализ иприкладныеиспытания ФПРисунок 5 – Схема получения ферментных препаратов с использованиеммицелиальных грибов в качестве реципиентаПервый этап заключается в амплификации и клонировании целевого гена всоответствующиеэкспрессионныевекторы.Полученнуюэкспрессионнуюплазмиду трансформируют в клетки E.

coli для определения последовательностиклонированного гена (чтобы исключить делеции, мутации и инсерции). Затем,осуществляют накопление и выделение достаточного для трансформацииколичества ДНК (около 10 мкг). После этого экспрессионную плазмиду, вместе сплазмидой, содержащей селективный маркер, трансформируют в грибныепротопласты. Следующим шагом является первичный скрининг грибныхрекомбинантных клонов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) для41определенияхромосомнойинтеграциицелевыхгенов.Далеепроводятферментацию полученных трансформантов в качалочных колбах с цельюопределения уровня биосинтеза базовых и целевых активностей. Последний этап– культивирование полученных рекомбинантных штаммов в ферментерах сполучением опытных образцов ФП для проведения прикладных испытаний [11].1.4.2 Создание экспрессионной системы на основе штамма P.

canescensНесмотря на наличие перспективных грибных штаммов-реципиентов родаAspergillus и Trichoderma, поиск эффективной экспрессионной системы на основеновых грибных штаммов является весьма актуальной задачей.В начале 1980-х годов проводились исследования по выделению грибныхпочвенных изолятовиизучениюих способностисинтезироватьновыегемицеллюлазы. В результате скрининга был выделен грибной штамм,продуцирующий эндо-1,4-β-ксиланазу (КсилА), β-галактозидазу (БГАЛ) иарабиноксилан-фураногидролаза А (АБФА). Штамм способен расти в широкомдиапазоне рН (4,5–6,0) и температуры (25–35°С). На основании морфологическиххарактеристик изолят был классифицирован как P. canescens и депонирован воВсероссийскую коллекцию микроорганизмов (ВКМ) РАН наук под номером ВКМF-178.

Во ВНИИГенетика и ФИЦ Биотехнологии РАН на основе выделенногоштамма P. canescens была создана платформа для получения рекомбинантныхштаммов-продуцентов мультиэнзимных комплексов [11].1.4.2.1 Выбор селективного маркера для штамма P. canescensДля штамма P. canescens F-178 был разработан селективный маркер,основанный на комплементации niaD- мутантов, лишенных активности понитратредуктазе,сиспользованиемгомологичногоструктурногогенанитратредуктазы (niaD). Известно, что фермент нитратредуктаза способствуетутилизации нитрата в качестве единственного источника азота и, возможно,42одновременноконтролируеттранспортаминокислотвклетку.Системыгенетической трансформации с геном niaD широко используют в грибах родаAspergillus и родственных им мицелиальных грибах, так как они даютвозможность применять прямую селекцию для мутантного и дикого фенотипов.