Диссертация (Создание новых комплексных ферментных препаратов грибных протеаз на основе штамма Penicillium canescens для эффективной конверсии белоксодержащего растительного сырья), страница 9

А.Н. Баха РАН (ФИЦ Биотехнологии РАН).Для получения достаточного количества ДНК материала с цельютрансформацииреципиентногоштамма,плазмиднаяДНКбылатрансформирована в компетентные клетки штамма бактерии E. coli MachI(«Invitrogen», США), полученные трансформанты были прокультивированы настандартной среде Lauria-Bertrani («Sigma», США) и, далее, необходимоеколичество плазмидной ДНК было выделено согласно стандартной методикефирмы «Qiagen» (США).2.3 Получение плазмидных конструкцийПолинуклеотидныепоследовательности,соответствующиеполноразмерному гену pepA из штамма P.

canescens, гену lapI из штамма A. oryzaeи гену alp из штамма A. oryzae были амплифицированы методом ПЦР, где вкачестве матрицы использовали геномные ДНК A. oryzae и P. canescens,соответственно, выделенные с помощью набора фирмы «Qiagen» (США) постандартным протоколам. Для амплификации последовательности использовалипраймеры:49pepA-UpLICCAAACAGAAGCAACCGACACAATGGTTGTCTTCAGCCAGATCACGpepA-LowLICAGAGCAAGCCGAGCAGGTTAGGCCTGGGGAGCGAAGCCAAGAAbf_Lap-UPGCAAAGCAGAAAAATGCGTTTCCTCCCCTGCATCGCGACTTTGGCAAbf_Lap-LOWAGAGCAAGCCGAGCAGGTTTACAGCGAATCTGCGAAGGCAAGCTCATATGAlcPr_Aor-LowLICAGAGCAAGCCGAGCAGGTTAAGCGTTACCGTTGTAGGCAAGCAGGTTAGAlcPr_Aor-UpLICGCACAGGCAGCAGGAGCTGCCCCTGTGCAGGAAACCCGCCGGGCCGCTGПЦР проводили на приборе MyCycler («BioRad», США) по следующемупротоколу: 95℃ – 4 мин – 1 цикл; 95℃ – 1 мин 30 сек, 50℃ – 1мин, 68℃ – 2 мин –25 циклов; 68℃ – 10мин, 4℃ – 30 мин.

Полученные ПЦР-продукты быликлонированы в вектор pXEG,pAbfA и pXEGuniversal, соответственно,сиспользованием метода независимого лигирования. Для этого они были выделеныиз агарозного геля и очищены с использованием набора реагентов фирмы«Qiagen» (США). Далее ПЦР-продукты были обработаны T4-ДНК-полимеразой(«Fermentas», США) в присутствии dATP (как необходимого нуклеотида,подходящего для прерывания 3`-5` экзонуклеазной активности полимеразы).Затем обработанные вставки были лигированы в pXEG, pAbfA и pXEGuniversalвекторы, соответственно, путем смешивания 50 нг вектора и 150 нг вставки.Смесь инкубировали при 22℃ в течение 30 мин, после чего трансформировали вклетки E.

сoli MachI в присутствии ампициллина (100 мкг/см3) по стандартномупротоколу трансформации, описанному в стандартных лабораторных протоколах.Далее, полученные бактериальные колонии были скринированы методомПЦР. Бактериальный материал был использован в качестве матрицы для ПЦР, вкачестве праймеров для скрининга использовались олигонуклеотиды дляклонированиясоответствующихгеновипраймеры,комплементарныепромоторной области вставки. Положительные колонии были использованы длявыделения плазмидной ДНК, которая была секвенирована по методу Сэнгера.50Нуклеотидныепоследовательности соответствующих геновнесодержалимутаций, инсерций или делеций.Ниже приведены схематические карты плазмид pPrXEG-PEP (рисунок 8а),pPrABF-LAP (рисунок 8б) и pPrXEG_alcPr_Aor (рисунок 8в).(а))(б)(в))Рисунок 8 – Схематичное изображение плазмид pPrXEG-PEP(а), pPrABFLAP(б) и pPrXEG_alcPr_Aor (в)2.4 Получение протопластов и трансформация реципиентного штамма2.4.1 Получение компетентных клеток реципиентного штамма P.

canescensRN3-11-7 niaDШтамм P. canescens RN3-11-7 niaD- выращивали на жидкой среде PM с10мМ NH4Cl и 1% глюкозы при 30℃ и 200–250 об/мин в течение 12–14 ч.Полученный мицелий фильтровали и ресуспендировали в буфере FBP (1,2М51MgSO4, 10мM NaH2PO4, pH 5,8). Вносили лизирующий фермент – Lysing Enzymesиз T. harzianum (SIGMA:L1412) в концентрации 15 мг/см3 и БСА в концентрации2,5 мг/см3 и инкубировали при 30℃ в течение 2–3 ч в термостатируемом шейкере(200–500 об/мин).Наслаивали равный объем буфера ST (0,6М сорбитол, 0,01М триc-НСl pH7,0). Центрифугировали при 4000 об/мин в течение 15–20 мин при температуре 8–10℃. Отбирали слой протопластов, который образуется на границе разделарастворов и переносили его в стерильную пробирку объемом 2 см3, промывалидва раза в буфере ST, и ресуспендировали протопласты в 2 см3 буфера SCT (1,2Мсорбитол, 0,01М триc-НСl, 0,01M CaCl2, pH 7,5).Количество полученных протопластов определяли при помощи камерыГоряева по формуле:количество протопластов в 1 см3 = Х  4  106,где Х – количество протопластов в маленькой клетке камеры Горяева.2.4.2 ТрансформацияНа одну трансформационную точку использовали 3×107 протопластов,растворенных в 0,2 см3 буфера SCT, 10 и 1 мкг целевой и котрансформационнойДНК, соответственно, и 0,05 см3 буфера PCT (50% ПЭГ-4000, 0,01М трис-НСl,0,01М СaCl2, рН 7,5).Смесь инкубировали во льду в течение 20 мин.

Затем добавляли к ней 0,5см3 буфера PCT, инкубировали 5 мин при комнатной температуре иперерастворяли в 0,2 см3 1,2М сорбитола.2.4.3 Рассев протопластов на агаризованные средыДля рассева использовали чашки Петри с нижним агаром и пробирки сверхним агаром. В состав верхнего агара входили агар-агар (0,7%), 1,2Мсорбитол, глюкоза (0,8%) и источник азота, нитрат натрия (селективная среда)52или хлорид аммония (неселективная среда).

Состав нижнего агара отличалсятолько концентрацией агара – 2%. Пробирки с верхним агаром перед посевомпомещали в кипящую водяную баню, чтобы расплавить агар, а затем в водянойтермостат при температуре 48℃, чтобы остудить его.Трансформационную смесь добавляли в пробирки с расплавленным иостывшим до 48℃ верхним агаром, содержимое пробирки перемешивали ивыливали на чашку Петри с нижним агаром. Трансформанты высевали населективную среду, в качестве контролей делали посев протопластов без ДНК населективную и неселективную среду.Чашки с трансформантами и контролями инкубировали в течение 5 сутокпри температуре 30℃.2.5 Среды для культивирования штаммовБиомассу исходного штамма-реципиента для трансформации получали сиспользованием минимальной среды РМ, содержавшей (% масс.): KH2PO4 – 0,15,KCl – 0,05, MgSO4×7H2O – 0,05, H3BO3 – 0,00025, CuSO4×5H2O – 0,002,FeSO4×7H2O – 0,004, MnSO4×2H2O – 0,004, Na2MoO4×2H2O – 0,004, ZnSO4×7H2O– 0,004, глюкозу – 1,0, NH4Cl – 10мМ.

Трансформанты высевали наагаризованную минимальную среду (2,0 % масс), в которой NH4Cl (10мМ) былзаменен на NaNO3 (10мМ). Споровый посевной материал штаммов получали ихранили на среде SM следующего состава (% масс.): глюкоза – 1,0, КН2РО4 – 1,0,дрожжевой экстракт – 0,5, агар-агар – 2,0, штамм выращивали не менее 7 сутокпри 30℃.Для глубинного культивирования штаммов использовали ферментационнуюсреду следующего состава (% масс.): соевая шелуха – 4,5, кукурузный экстракт –5,0, KH2PO4 – 2,5. Культивирование продуцентов осуществляли в колбах объемом750 см3 в 100 см3 ферментационной среды на качалке (240 об/мин) при 30℃ втечение 144 ч.

КЖ отделяли от мицелия центрифугированием в течение 10 минпри 10750 g.53Для приготовления засевных дрожжей использовали солодовое суслоплотностью 12Б. Выращивание засевных дрожжей проводили при 30℃ в течение24 ч.2.6 Ферментные препаратыВ качестве сравнения в работе использовались коммерческие ФП: ProtofermFP (Shandong Longda Bio-Products Co., Ltd., Китай), Палпфор 2 (ООО«Микробиопром», Россия), Acid Protease (Beijing Challenge Bio-technology Limitedcompany, Китай).2.7 СубстратыДля определения ферментативных активностей использовали следующиесубстраты: гемоглобин, казеинат натрия, ксилан из древесины березы, β-глюканячменя, L-лейцин-пара(4)-нитроанилид («Sigma», США).Для проведения прикладных испытаний ФП использовали пшеничную,соевую и ржаную муку (ООО «Гарнец», Россия), тритикале (ФГБНУ ДЗНИИСХРАН,Россия),послеспиртовуюсухуюбарду(ОАО«УржумскийСпиртоводочный завод», Россия), соевый шрот («Интер-Агро», Россия).2.8 Определение активности ферментовМетод определения протеолитической активности основан на гидролизегемоглобина (или казеината натрия) исследуемым ФП до низкомолекулярныхпептидовисвободныхаминокислотспоследующимосаждениемнепрогидролизованного белка трихлоруксусной кислотой (ТХУ) и определениемобразовавшихпептидовисвободныхаминокислот.Заединицуобщейпротеолитической активности (ПС) принимали такое количество фермента,которое за 1 мин при 30℃ приводит гемоглобин (или казеинат натрия) в54неосаждаемое состояние ТХУ в количестве, соответствующем 1 мкмолю тирозина(1 мкмоль тирозина равен 0,181 мг) [130].Метод HUT использовался для определения протеолитической активностиФП кислых протеаз в опытах in vivo.

Метод основан на 30-мин ферментативномгидролизе гемоглобина при рН 4,7 и 40℃ с последующим осаждениемнепрогидролизованногосубстратаТХУ.Заединицупротеолитическойактивности принимается такое количество гидролизата, которое при абсорбции275 нм равно 1,10 мг/см3 тирозина в 0,006Н HCl [131].МетодактивностиФОЛПФПиспользовалсясериновойдляпротеазывопределенияопытахinпротеолитическойvivo.Заединицупротеолитической активности принято такое количество фермента, котороекатализирует гидролиз 1 г белка (казеина) в строго определенных стандартныхусловиях: температура 40℃, рН 10,5 и время гидролиза 1 ч [132].Метод определения лейцинаминопептидазной активности (ЛАПА) основанна действии аминопептидазы на субстрат L-лейцин-пара(4)-нитроанилид свысвобождением пара-нитроанилина, окрашенного в желтый цвет вещества [133].Метод определения ксиланазной активности основан на измерениискорости образования восстанавливающих сахаров (ВС) методом ШомодиНельсона при гидролизе ксилана из древесины березы.

За единицу ксиланазнойактивности принимали такое количество фермента, которое приводит кобразованию 1 мкмоль ВС (в ксилозном эквиваленте) из 1%-ного раствораксилана за 1 мин при 50℃ и рН 5,0 [134].Метод определения β-глюканазной активности основан на измерениискорости образования восстанавливающих сахаров (ВС) методом ШомодиНельсона при гидролизе β-глюкана ячменя. За единицу β-глюканазной активностипринимали такое количество фермента, которое приводит к образованию 1мкмоль ВС (в глюкозном эквиваленте) из 1%-ного раствора β-глюкана за 1 минпри 50℃ и рН 5,0 [134].552.9 Определение концентрации белкаСодержание белка определяли по методу Лоури, используя в качествестандарта бычий сывороточный альбумин (БСА) [135].2.10 Электрофорез в полиакриламидном гелеБелковыйэлектрофорезвполиакриламидномгеле(ПААГ)сдодецилсульфатом натрия (ДДС-NA) проводили в камере для вертикальногоэлектрофореза Mini-PROTEAN Tetra System фирмы «BioRad» (США).При изготовлении пластин (70х80х0,75 мм) с ПААГ для электрофореза вденатурирующих условиях (ДДС-ЭФ) с концентрирующим (4%) и разделяющим(12%) гелями использовали реактивы и наборы производства фирмы «Helicon»(Россия).