Диссертация (Создание новых комплексных ферментных препаратов грибных протеаз на основе штамма Penicillium canescens для эффективной конверсии белоксодержащего растительного сырья)

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТПИЩЕВОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ –филиал Федерального государственного бюджетного учреждения наукиФедерального исследовательского центра питания, биотехнологии и безопасностипищи (ВНИИПБТ – филиал ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»)На правах рукописиВЕЛИКОРЕЦКАЯ Ирина АлександровнаСОЗДАНИЕ НОВЫХ КОМПЛЕКСНЫХ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВГРИБНЫХ ПРОТЕАЗ НА ОСНОВЕ ШТАММА PENICILLIUM CANESCENSДЛЯ ЭФФЕКТИВНОЙ КОНВЕРСИИ БЕЛОКСОДЕРЖАЩЕГОРАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯСпециальность 05.18.07 – Биотехнология пищевых продуктов и биологическиактивных веществДиссертация на соискание ученой степени кандидата технических наукНаучный руководительд.х.н., проф.

Синицын А.П.Москва – 2019ОГЛАВЛЕНИЕВВЕДЕНИЕ .................................................................................................................. 61ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ ...................................................... 131.1 Протеолитические ферменты .............................................................................

131.1.1 Экзопептидазы ................................................................................................. 151.1.2 Эндопептидазы ................................................................................................. 181.2 Применение протеолитических ферментов при гидролизе растительногобелоксодержащего сырья........................................................................................... 241.2.1 Основные виды белоксодержащего растительного сырья ............................

241.2.1.1 Характеристика зернового сырья................................................................. 241.2.1.2 Характеристика бобового сырья .................................................................. 291.2.2 Применение протеолитических ферментов при переработке растительногосырья ........................................................................................................................... 311.3 Грибные продуценты протеаз .............................................................................

351.4 Подходы к получению грибных рекомбинантных продуцентов ...................... 391.4.1 Использование мицелиальных грибов для продукции рекомбинантныхбелков.......................................................................................................................... 391.4.2 Создание экспрессионной системы на основе штамма P. canescens ............

421.4.2.1 Выбор селективного маркера для штамма P. canescens ............................. 421.4.2.2 Идентификация и выделение сильных промоторов для экспрессии генов ........................................................................................................................... 45ЗАКЛЮЧЕНИЕ .......................................................................................................... 472ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ.................. 482.1 Штаммы-микроорганизмы ..................................................................................

482.2 Используемые плазмидные конструкции .......................................................... 492.3 Получение плазмидных конструкций ................................................................ 492.4 Получение протопластов и трансформация реципиентного штамма ............... 512.4.1 Получение компетентных клеток реципиентного штамма P. canescens RN311-7 niaD- .................................................................................................................... 512.4.2 Трансформация ................................................................................................ 5222.4.3 Рассев протопластов на агаризованные среды ...............................................

522.5 Среды для культивирования штаммов ............................................................... 532.6 Ферментные препараты....................................................................................... 542.7 Субстраты ............................................................................................................ 542.8 Определение активности ферментов .................................................................. 542.9 Определение концентрации белка ...................................................................... 562.10 Электрофорез в полиакриламидном геле ....................................................... 562.11 Определение рН- и температурных оптимумов ферментных препаратов ....

562.12 Определение термостабильности ферментных препаратов .......................... 572.13 Анализ компонентного состава ферментных препаратов ............................. 572.14 Методы анализа сусла и бражки ..................................................................... 582.15 Структура экспериментальных исследований ............................................... 583РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ...............................................................

603.1 Получение рекомбинантных штаммов ............................................................... 603.1.1 Создание продуцента пенициллопепсина – трансформация штамма P.canescens RN3-11-7 niaD- плазмидой pPrXEG_PEP ................................................. 603.1.2 Создание продуцента пенициллопепсина и лейцинаминопептидазы –котрансформация штамма P. canescens RN3-11-7 niaD- плазмидами pPrXEG_PEP иpPrAbf_Lap .................................................................................................................

653.1.3 Создание продуцента комплекса протеаз – котрансформация штамма P.canescens RN3-11-7 niaD- плазмидами pPrXEG_alcPr_Aor, pPrXEG_PEP иpPrAbf_Lap1 ............................................................................................................... 673.1.3.1 Оптимизация методики электрофоретического анализа культуральнойжидкости трансформантов P. canescens, имеющих активность сериновой протеазы........................................................................................................................

703.1.4 Создание продуцента сериновой протеазы – трансформация штамма P.canescens RN3-11-7 niaD- плазмидой pPrXEG_alcPr_Aor ........................................ 723.1.4.1 Профили рН- и температурной зависимости активности сериновойпротеазы штамма P. canescens Oryzin-25 .................................................................. 7433.1.4.2 Индукция биосинтеза сериновой протеазы штаммом P.

canescens Oryzin25 при глубинном культивировании ......................................................................... 753.1.5 Исследование стабильности полученных рекомбинантных штаммов припоследовательных пересевах ..................................................................................... 773.2 Получение сухих ферментных препаратов на основе новых рекомбинантныхштаммов P.

canescens ................................................................................................. 833.2.1 Получение сухого ферментного препарата пенициллопепсина на основештамма P. canescens Pep-4 ........................................................................................ 833.2.2 Получение сухого ферментного препарата пенициллопепсина илейцинаминопептидазы на основе штамма P.

canescens RN3-11-7-7 ..................... 853.2.3 Получение сухих комплексных ферментных препаратов протеаз на основерекомбинантных штаммов P. canescens ................................................................... 873.3 Масштабирование процесса культивирования рекомбинантных штаммов вусловиях промышленного производства .................................................................. 893.4 Свойства и состав ферментных препаратов, полученных с помощью новыхрекомбинантных штаммов P. canescens ................................................................... 923.4.1 рН и температурные оптимумы целевых активностей .................................. 923.4.2 Термостабильность ферментов ....................................................................... 933.4.3 Компонентный состав ферментных препаратов ............................................

953.5 Прикладные испытания новых ферментных препаратов, полученных спомощью рекомбинантных штаммов ..................................................................... 1003.5.1 Исследование эффективности применения ферментного препаратапенициллопепсина и лейцинаминопептидазы для интенсификации спиртовогоброжения ................................................................................................................... 1003.5.2 Результаты испытаний in vitro ферментного препарата Пенициллопепсина вкачестве кормовой добавки на зерновом сырье ..................................................... 1043.5.3 Результаты испытаний in vitro ферментных препаратов сериновой протеазыP.

canescens в качестве кормовой добавки на соевом сырье ................................. 1073.5.4 Результаты испытаний in vivo комплексных ферментных препаратов повлиянию на продуктивность и физиологическое состояние свиней при откорме 11143.5.4.1 Расчет экономической эффективности производства свинины сиспользованием новых ферментных препаратов в составе комбикормов ............ 114ВЫВОДЫ ................................................................................................................. 117СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ......................................................................................

119СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ........................................................................................ 121ПРИЛОЖЕНИЯ ........................................................................................................ 1375ВВЕДЕНИЕАктуальность темы исследования. В настоящее время пищевая иперерабатывающая промышленность Российской Федерации является одной изстратегическихотраслейэкономики,обеспечивающейнаселениестранынеобходимыми качественными продуктами питания. В России разработана иреализуется Стратегия развития пищевой и перерабатывающей промышленностиРоссийской Федерации на период до 2020 года, нацеленная на созданиенеобходимых условий для модернизации промышленности, формирование новоготехнологического уклада, повышение технического уровня производства за счетиспользования современных достижений научно-технического прогресса, а такжерешениепроблемынеобходимостьимпортозамещения.внедренияновыхСредитехнологийпоставленныхвотраслизадач–пищевойиперерабатывающей промышленности, в том числе биотехнологий, позволяющихзначительно расширить выработку продуктов нового поколения с заданнымикачественными характеристиками, повысить глубину переработки, что позволитувеличить выход готовой продукции с единицы перерабатываемого сырья [1].Однимизвидовсырьяпищевойпромышленностиявляетсябелоксодержащее растительное сырье.