Диссертация (Создание новых комплексных ферментных препаратов грибных протеаз на основе штамма Penicillium canescens для эффективной конверсии белоксодержащего растительного сырья), страница 10

Окраску белка в гелях производили красителем Coomassie-Brilliant BlueG-250 производства Helicon (Россия). Перед электрофорезом исследуемыерастворы ферментов предварительно обрабатывали 1% ДДС-Na и 5% βмеркаптоэтанолом при 100℃ в течение 15 мин.Для определения молекулярной массы использовали смеси белков-маркеров(14,4–97 кДа и 20–116 кДа) – набор SDS-PAGE Standards, Low Range («Bio-Rad»,США).2.11 Определение рН- и температурных оптимумов ферментных препаратовОпределение pH-профиля протеолитической активности в ФП проводилипри 30℃ в диапазоне значений pH от 3,0 до 11,0.

Для рН-профиля активностиксиланазы измерения проводили при 50℃ в диапазоне значений pH от 3,0 до 9,0.Для рН-профиля активности ЛАП измерения проводили при 30℃ в диапазонезначений pH от 4,0 до 11,0. Для создания растворов с заданным значением pHиспользовали 0,1 М универсальный буфер.56Определениетемпературногопрофиляактивностикислойпротеазыпроводили при рН 4,7 в диапазоне температур от 30 до 70℃; температурногопрофиля активности щелочной протеазы – прп рН 10,0 в диапазоне температур от30 до 70℃; температурного профиля активности ксиланазы – при рН 5,0 вдиапазоне температур от 25 до 90℃; температурного профиля активности ЛАП –при рН 5,0 в диапазоне температур от 30 до 90℃.Результатымаксимальногоизмеренийзначенияотображалиактивности,награфикахнаблюдаемойввпроцентахоптимумерНотитемпературы.2.12 Определение термостабильности ферментных препаратовИсследованиетермостабильностиполученныхФПпроводилипритемпературе от 30 до 70℃.

В термостатируемую пробирку помещали растворфермента и через определенные промежутки времени отбирали пробы, в которыхопределяли активности по отношению к субстратам в стандартных условиях (см.выше). Результаты отображали в виде зависимости остаточной активности после90 минут инкубирования от температур, за 100% принимали начальнуюактивность раствора фермента.2.13 Анализ компонентного состава ферментных препаратовДляфракционированияФПиспользовалижидкостнойхроматографсреднего давления FPLC фирмы «Pharmacia» (Швеция).

Система FPLC состоялаиз двух насосов P-500, миксера, инжектора, колонки с соответствующимносителем, ультрафиолетового проточного детектора (280 нм), самописца иколлектора фракций.Обессоливание проводили методом ГПХ на колонке с носителем BioGel P6,уравновешеннойбуфером0,02Мbis-Tris/HCl,рН6,8.Ионообменнуюхроматографию обессоленных препаратов проводили на колонке с носителем57Source 15 Q. Пробу, содержавшую 10 мг белка, наносили на колонку,уравновешенную 0,02 М Bis-Tris/HCl, рН 6,8. Несвязавшийся белок смывалистартовым буфером, а связавшийся белок элюировали в градиенте ионной силы.Градиент задавали линейным изменением концентрации NaCl от 0 до 0,4 М прискорости потока 1 см3/мин (объем градиента 40 см3).

Во фракциях, собранных впроцессе хроматографирования, доводили значение рН до пяти, добавляя 10% (пообъему) 1 М Na-ацетатного буфера с рН 5,0.2.14 Методы анализа сусла и бражкиКислотность сусла и бражки определяли титрованием 0,1Н растворомщелочи. Один градус кислотности соответствует 1 см3 1Н раствора щелочи,расходуемой на нейтрализацию кислот, содержащихся в 20 см3 фильтрата [136].Концентрацию сухих веществ в сусле и видимую концентрацию сухихвеществ в фильтрате бражки определяли сахарометрическим методом [136].Объемную концентрацию спирта определяли на автоматическом прибореDensimat-Alcomat2(«GibertiniElettronicaS.R.L.»,Италия)вдистилляте,бражкепроводилиполученном после отгонки его из бражки.Определениенесброженныхуглеводоввколориметрическим методом, основанным на расщеплении сложных углеводов домоносахаров в сильнокислой среде с последующей их дегидратацией иобразованием оксиметилфурфурола, который, вступая в реакцию с антроном,образует комплексное соединение синевато-зеленого цвета [136].Влажность измеряли на приборе ЭВЛАС-2М («Сибагроприбор», Россия)согласно инструкции.2.15 Структура экспериментальных исследованийОсновные этапы исследований выполнялись в соответствии со схемой,представленной на рисунке 9.58Штамм P.

canescens RN3-11-7 niaD-Котрансформацияштамма плазмидамиpPrXEG_PEPpPrAbf_Lap1pPrXEG_alcPr_AorПолучение штаммаP. canescens Oryzin-3Котрансформацияштамма плазмидамиpPrXEG_PEPpPrAbf_LapПолучение штаммаP. canescens RN3-11-7-7Трансформацияштамма плазмидойpPrXEG_PEPПолучение штаммаP. canescens Pep-4Трансформацияштамма плазмидойpPrXEG_alcPr_AorПолучение штаммаP. canescens Oryzin-25Исследование стабильности полученных рекомбинантных штаммов при пересевахПолучение лабораторных и промышленных образцов ФПИзучение физико-химических свойств ФППрикладные испытания ФП на белоксодержащем растительном сырьеIn vitro “кормовые”испытания ФП назерновом сырьеИнтенсификацияспиртового броженияIn vitro “кормовые” испытанияФП на бобовом сырьеИспытания ФП in vivo напродуктивность свиней при откормеРисунок 9 – Структурная схема экспериментальных исследований593 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ3.1 Получение рекомбинантных штаммовЛитературные данные свидетельствуют об актуальности применениягрибных протеаз в различных отраслях промышленности и сельского хозяйства.Именно с этой целью мы проводили исследования по созданию на основереципиентного штамма P.

canescens RN3-11-7 niaD- продуцентов наиболеезначимых и, в то же время, дефицитных на рынке коммерческих ФП грибныхпротеаз:кислойаспартатнойпротеазы(пенициллопепсина),лейцинаминопептидазы и сериновой протеазы (оризина).3.1.1 Создание продуцента пенициллопепсина – трансформация штамма P.canescens RN3-11-7 niaD- плазмидой pPrXEG_PEPДля получения высокоактивного продуцентаПЕП была проведенатрансформация штамма P.

canescens RN3-11-7 niaD- целевой плазмидойpPrXEG_PEP, содержащей ген ПЕП P. canescens под ксиланазным промотором,совместно с плазмидой pSTA10 (niaD+), соотношение целевой плазмиды иpSTA10составлялотрансформации10:1.составилаБыловполученосреднем994трансформанта,трансформантовначастота1мкгтрансформированной ДНК. Для первоначального скрининга трансформанты,выросшие на агаризованной среде с 1,2М сорбитолом и NaNO3, были пересеянына селективную среду РМ с NaNO3 (состав среды приведён в разделе 2.5). Далеетрансформанты культивировали в качалочных колбах в течение 6 суток, поокончании ферментации отбирали пробы КЖ для определения ПС (используягемоглобин в качестве субстрата) и концентрации белка. В качестве контроля длявсех опытов использовали реципиентный штамм P.

canescens RN3-11-7 niaD-.Полученныерезультаты(таблица5)продемонстрировалисущественноеповышение уровня ПС в КЖ в большинстве выделенных трансформантов, что60свидетельствует об успешной гомологичной экспрессии гена пенициллопепсинареципиентным штаммом P. canescens.Таблица 5 – Общая протеолитическая активность и концентрация белка вкультуральной жидкости трансформантов P. canescens (колбы, 144 ч, 30℃)ПС, ед./см3ТрансформантрН 4,7, 30℃(гемоглобин)Белок,мг/см31,2915212011025,62210982387819419348228102141325410219203421010141510101011101711111314141012109111010911910981010129КонтрольP. canescens RN3-11-7 niaDcl 1cl 2cl 3cl 4cl 5cl 6cl 7cl 8cl 9cl 10cl 11cl 12cl 13cl 14cl 15cl 16cl 17cl 18cl 19cl 20cl 21cl 22cl 23cl 24cl 25cl 26cl 27cl 28cl 29cl 30cl 31cl 3261ПС, ед./см3ТрансформантрН 4,7, 30℃(гемоглобин)Белок,мг/см3cl 33cl 34cl 35cl 36cl 37cl 38cl 39cl 40cl 41cl 42cl 43cl 44cl 45cl 46cl 47cl 48cl 49cl 50cl 51cl 52cl 53cl 54cl 55cl 56cl 57cl 58cl 59cl 60cl 61cl 62cl 63cl 64cl 65cl 66cl 67cl 68cl 69cl 70cl 71cl 72221314233322362244416020131163647221177111372311221461139102127759598,5910101110111111,711,413,7991110111110999989910109810101181113810111362ПС, ед./см3ТрансформантрН 4,7, 30℃(гемоглобин)Белок,мг/см3cl 73cl 74cl 75cl 76cl 77cl 78cl 79cl 80cl 81cl 82cl 83cl 84cl 85cl 86cl 87cl 88cl 89cl 90cl 91cl 92cl 93cl 9455344658224211108511240189134513311112101011911108812121113111011121412111011Трансформанты с максимальной активностью были отобраны для анализабелкового состава с помощью ДДС-ЭФ.

На электрофореграмме КЖ всехотобранных трансформантов (рисунок 10) наблюдалась полоса с молекулярноймассой 43 кДа, предположительно, принадлежащая ПЕП.На основании полученных результатов были отобраны 3 штаммапродуцента (№№ 3, 4 и 68), протеолитическая активность которых была в 100–120 раз выше, чем у исходного (реципиентного) штамма (таблица 5), они былиподвергнуты вторичной проверке по описанной выше процедуре (пересев начашки Петри с последующим культивированием в качалочных колбах). УровеньПС в КЖ после вторичной проверки практически соответствовал наблюдаемойпри первичной проверке трансформантов (ср. таблицы 5 и 6).63PepXylРисунок 10 – Электрофореграмма образцов культуральной жидкостиотобранных трансформантовТаблица 6 – Активности целевых ферментов и концентрация белка вкультуральной жидкости наиболее активных трансформантов при вторичнойпроверке (cl 3, 4, 68) (колбы, 144 ч, 30ºС)ПС, ед./см3КсА, ед./см3ТрансформантрН 4,7, 30ºС(гемоглобин)рН 5,0, 50ºС(ксилан из древесины березы)Белок,мг/см3Контрольcl 3cl 4cl 681,20,21175,01108,71036,325025,816018,9230219012,291,2171,9171,7161,5Из отобранных вариантов наиболее активным являлся клон 4 (далее P.canescens Pep-4), протеолитическая активность которого в КЖ 110 раз выше, чему реципиентного штамма (1 и 110 ед./см3, соответственно), при этом ксиланазнаяактивность уменьшилась незначительно (250 и 230 ед./см3, соответственно).Таким образом, в результате трансформации плазмидой pPrXEG_PEP былсоздан рекомбинантный штамм P.

canescens Pep-4 – высокоактивный продуцентПЕП (110 ед./см3 КЖ), который, при этом, сохранил способность к активномубиосинтезу собственной ксиланазы (230 ед./см3 КЖ).643.1.2 Создание продуцента пенициллопепсина и лейцинаминопептидазы –котрансформация штамма P. canescens RN3-11-7 niaD- плазмидамиpPrXEG_PEP и pPrAbf_LapС целью создания высокоактивного продуцента комплекса грибных протеаз(эндо- и экзопептидаз) была проведена котрансформация реципиентного штаммаP. canescens RN3-11-7 niaD- следующими плазмидами: pPrXEG_PEP, несущей ген pepA P.