Диссертация (Создание новых комплексных ферментных препаратов грибных протеаз на основе штамма Penicillium canescens для эффективной конверсии белоксодержащего растительного сырья), страница 8

Ихотя генетические и биохимические основы этой системы были разработаны дляA. nidulans, экспериментальные методы были легко адаптированы для P.canescens F178 и его производных [121]. Применяют стандартный методкотрансформации,гомологичныхприкоторомауксотрофныхсмесьтрансформационныхселективныхмаркероввекторовииспользуютсявсоотношении (мкг ДНК) 10:1. Эффективность трансформации, как правило,составляет сотни трансформантов на мкг трансформирующей ДНК, с частотойкотрансформации 80% и выше [11].Для создания трансформационной системы, на основе штамма P. canescensF178 был получен реципиентный штамм P. canescens RN3-11-7 niaD- [11]согласно схеме, приведенной на рисунке 6.Рисунок 6 – Схема получения штамма P.

canescens RN3-11-7 niaD-43На первом этапе был проведен мутагенез штамма F-178 с использованиемультрафиолетового облучения (УФ) с целью увеличения его продуктивности.Далее, в результате обработки нитрозогуанидином (НГ), на основе P. canescensF178* был получен ауксотрофный штамм PCA-10 niaD-, дефектный по генунитратредуктазы. Оба штамма – P. canescens F178* и его niaD- мутант, проявлялиповышенную способность к синтезу ферментов БГАЛ (70–80 ед./см3) и КсилА(100 ед./см3) [122].Была исследована индукция биосинтеза секретируемых ферментов БГАЛ иКсилА в исходном штамме P.

canescens F178 и мутантном штамме P. canescensPCA10 niaD-. Биосинтез обоих ферментов индуцировался, в основном, арабинозойи арабитом, продуктом катаболизма арабинозы. Однако, индукция синтезаферментов происходила по-разному: максимальный уровень БГАЛ был достигнутпри концентрации арабинозы 1 мМ, а КсилА – 10 мМ. Кроме того, было показано,что экспрессия КсилА может быть инициирована 1 мМ ксилозы [123]. Индукторвзаимодействует с активатором транскрипции, транскрипционные активаторыксиланазы являются важными регуляторными белками для старта механизматранскрипции у грибов рода Aspergillus [124] и Trichoderma [125].

Поэтомугомологичный ген транскрипционного активатора ксиланазы P. canescens (xlnR)былклонированисеквенирован;былаполученаплазмидаpXR53итрансформирована в штамм P. canescens PCA10 niaD-. В результате был созданштамм P. canescens PCXlnR, продуцирующий высокий уровень ксиланазы насредах, содержащих свекловичный жом и соевую или овсяную шелуху. Этотрекомбинантный штамм стал платформой для получения нового ауксотрофногоштамма P. canescens PCXlnR niaD- (рабочее название – RN3-11-7 niaD-), которыйбыл использован в качестве реципиента для получения ряда рекомбинантныхштаммов и ФП [11].441.4.2.2 Идентификация и выделение сильных промоторов для экспрессиигеновТак называемые сильные промоторы, как правило, обеспечивают высокийуровень экспрессии целевого гена, что приводит к биосинтезу высокого уровнясоответствующего генного продукта.В связи с этим, были проведены исследования по идентификациипромоторов основных ферментов, синтезируемых штаммом P.

canescens RN3-11-7niaD-. Основные внеклеточные белки, секретируемые штаммом P. canescens –БГАЛ (120 кДа), КсилА (30 кДа) и АБФА (70 кДа), составляют приблизительно10, 20 и 25% от секретируемого ферментативного комплекса, соответственно[122, 126].Анализ нуклеотидной последовательности гена БГАЛ (bgas) и егопромоторной области показал наличие нескольких потенциальных CREAсвязывающих сайтов, ответственных за катаболитную репрессию. Были полученытрансформанты с увеличенным числом копий гена bgas и установлено, что βгалактозидазная активность трансформантов возрастает линейно с увеличениемчисла копий гена, пока не достигнет 12 копий на геном [121].Был клонирован и секвенирован полный ген xylA, кодирующий КсилА.

Впромоторной области были обнаружены нуклеотидные последовательности длясвязывания белка CREA, а также транскрипционного активатора xlnR. Был созданрядрекомбинантныхштаммовP.canescens,показывающих7-8-кратноеувеличение ксиланазной активности. Доля КсилА для наиболее продуктивныхштаммов составила 30-50% от общего пула секретируемого белка [127].Был клонирован и секвенирован полный ген abfA, кодирующий АБФА.Анализ нуклеотидной последовательности показал отсутствие каких-либо сайтовсвязываниядляCREAбелка.Однако,уровеньпродукцииАБФАвферментационной среде штамма P. canescens ниже, чем уровень секреции КсилАи БГАЛ при тех же условиях ферментации.

Несмотря на это, экспрессия целевыхгенов, основанная на abfA промоторе, может быть использована в том случае,45когда нужно добавить минорные фермент(ы) к секретируемому рекомбинантномумультиферментному комплексу [128].Такимобразом,наосноветрехпромоторовбылиразработанымультикопийные экспрессионные векторы PC1, PC2 и PC3 (рисунок 7), которыешироко используются в настоящее время для введения целевых рекомбинантныхгенов в реципиентные штаммы на основе P. canescens [11].(а)(б)(в)Рисунок 7 – Схематическое изображение мультикопийных векторов экспрессии:(а) PC1, где PxylA-промоторная область гена xylA; TxylA – терминаторная областьгена xylA; (б) PC2, где Pbgas-промоторная область гена bgas; Tbgas –терминаторная область гена bgas; (в) PC3, где Pabf-промоторная область генаabfA; Tbga – терминаторная область гена bgas; amp – ген устойчивости кампициллину, ЦГ – целевой ген.Таким образом, созданная универсальная система экспрессии позволяетиспользовать P.

canescens в качестве реципиента для создания новыхперспективных рекомбинантных штаммов и перспективных ФП, востребованныхразличными секторами промышленности.46ЗАКЛЮЧЕНИЕИзлитературныхисточниковочевиднаактуальностьприменениякомплексных препаратов грибных протеаз эндо- и экзодействия в различныхотраслях промышленности и сельского хозяйства. На российском рынке ФП, всвязи с отсутствием высокоактивных отечественных продуцентов, представлены,в основном, коммерческие препараты грибных протеаз зарубежных фирм.Поэтому представляется необходимым создание высокоактивных продуцентовгрибныхпротеаз,перспективныхконкурентоспособныхкомплексныхдляФП,получениясодержащихнаихосновеосновныегрибныепротеазы, в частности, кислую аспартатную протеазу, лейцинаминопептидазу исериновую протеазу.Проведенный анализ литературных данных показал перспективностьштамма P.

canescens как продуцента для производства промышленно-значимыхферментов, благодаря высокой скорости роста и развитой системе биосинтезавнеклеточныхферментационныеферментов,способностиутилизироватьсреды и легкости масштабированиянедорогиеферментационногопроцесса. Созданная в ФИЦ «Биотехнологии» РАН универсальная системаэкспрессии позволяет использовать P.

canescens в качестве реципиента длясоздания новых перспективных рекомбинантных штаммов и перспективных ФП,востребованных различными секторами промышленности.Целью наших исследований, как уже отмечалось выше, являлось создание сиспользованием методов селекции и генетической инженерии на основе штаммаP. canescens RN3-11-7 niaD- высокоактивных продуцентов комплекса протеаз сширокой специфичностью действия, получение на основе новых рекомбинантныхштаммов ФП, изучение их состава и свойств и использование полученных ФП дляповышения эффективности биотехнологических процессов.472 ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВИсследования проводили в лабораторных условиях ВНИИПБТ (филиалФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»), «ФИЦ Биотехнологии РАН» (ИНБИим.

А.Н. Баха РАН), кафедры химической энзимологии МГУ имени М.В.Ломоносова; в лабораторных и опытно-промышленных условиях ИБФМ им. Г.К.СкрябинаРАН(подразделениеФИЦПНЦБИРАН,г.Пущино);впроизводственных условиях завода ООО «Агрофермент» (Тамбовская обл., с.Старосеславино);испытанияinvivoпроводиливусловиях племзавода«Орловский» (Тамбовская область).2.1 Штаммы-микроорганизмыВ качестве реципиентного штамма использовали предоставленный ИНБИим. А.Н. Баха РАН штамм P. canescens RN3-11-7 niaD-, дефектный по гену niaD,кодирующему нитратредуктазу.

Данный штамм является продуцентом комплексакарбогидраз (Ксил, α-L-арабинофуранозидазу, АБФА и α-галактозидазу А и С,БГАЛ) [126, 129].Для субклонирования целевых генов, а также для препаративногополучения ДНК использовали штамм E. coli MachI (ΔrecA1398 endA1 tonAΦ80ΔlacM15 ΔlacX74 hsdR(rm)) фирмы «Invitrogen» (США).Штаммы, полученные в ходе работы: P. canescens Pep-4 – продуцент кислойпротеазы и ксиланазы; P.

canescens RN3-11-7-7 – продуцент кислой протеазы,ЛАП и ксиланаза; P. canescens Oryzin-25 – продуцент щелочной сериновойпротеазы и ксиланаза.Для проведения бродильных проб использовали дрожжи S. cerevisiae 985Т.482.2 Используемые плазмидные конструкцииЭкспрессионные плазмидные конструкции: 1) pPrXEG_PEP, несущаяцелевой ген пенициллопепсина (pepA) из P. canescens под ксиланазнымпромотором гриба P. canescens, 2) pPrAbf_Lap1, в составе которой ген ЛАП (lapI)из A. oryzae находится под арабинофуранозидазным промотором, и 3)pPrXEG_alcPr_Aor, несущей ген сериновой протеазы A. oryzae (alp) подксиланазным промотором были получены в лаборатории Биотехнологииферментов ИНБИ им.