Диссертация (Создание новых комплексных ферментных препаратов грибных протеаз на основе штамма Penicillium canescens для эффективной конверсии белоксодержащего растительного сырья), страница 4

oryzae). После процессинга образуется активный «зрелый» пептид [39].Цистеиновые (тиоловые) эндопептидазы содержат в активном центреостатки цистеина и гистидина, обусловливающие их каталитическую активность.Тиоловые протеазы ингибируются парахлормеркурибензоатом, монойодуксуснойкислотой и другими окислителями, а также катионами тяжелых металлов [4, 39].Активируютсявосстановителями(2-меркаптоэтанолом,дитиотреитолом,цистеином, бисульфитом натрия и пр.) [39]. Большинство цистеиновых протеаз20имеют слабокислый или нейтральный рН-оптимум, однако некоторые из них,например, лизосомальные протеазы, проявляют максимальную активность вкислой зоне рН.

К данному подклассу относится ряд важных протеазрастительногопроисхождения,такихкакпапаин,фицин,бромелаин,химопапаины A и B, и некоторые микробные протеазы [3, 28]. Папаин,бромелаин, фицин – протеазы широкой субстратной специфичности. Онигидролизуют в белках пептидные связи, образованные лейцином или глицином.Другие типы связей, в том числе характерные для специфичности пепсина,трипсина, химотрипсина, карбоксипептидазы, также могут расщепляться, хотя и сменьшей скоростью.

В мицелиальных грибах их находят редко. Микробныетиоловые протеазы наиболее активны при рН 7,0–8,8 [3, 4].Металлоэндопептидазысодержатвактивномцентрекатионыдвухвалентных металлов (Zn2+, Mg2+, Mn2+ или Co2+) [40]. Металлопротеазывключают ферменты различного происхождения, такие как коллагеназы высшихмикроорганизмов, геморрагические токсины змеиного яда, термолизин бактерийи др. Встречаются как нейтральные металлопротеазы с оптимумом активностипри рН 7,0–8,0, проявляющие специфичность к гидрофобным аминокислотам, таки щелочные с рН-оптимумом 9,0 и более широкой субстратной специфичностью.Наиболее известными и широко используемыми металлопротеазами являютсятермолизин, коллагеназа и эластаза макрофагов (металлоэластаза EC 3.4.24.65)[3]. Все металлопротеазы ингибируются хелатными агентами (EDTA, EGTA, офенантролином и др.). Инактивация чаще всего носит обратимый характер [12].Треониновые эндопептидазы содержат в активном центре остатки треонина.Представителиэтогоклассавходятвсоставотносительнохорошоохарактеризованного протеолитического комплекса – протеасомы [34].

Наиболеешироко распространены треониновые пептидазы семейств Т1-3 [14].Аспартатные эндопептидазы содержат в активном центре диаду остатковаспарагина, один из которых – в ионизированной форме, другой – впротонированной. Катализ аспартатных протеаз идет по общему кислотноосновному механизму. Каталитическая диада, проявляя основные свойства,21активирует молекулу воды, принимая на себя протон. Активированная молекулаводы, выступающая в роли нуклеофила, атакует карбонильный атом углеродарасщепляемой пептидной связи [12]. К аспартатным протеазам относят рядгомологичных протеаз: пепсин, химозин, ренин, катепсин D и родственныеферменты.

За исключением ренина, оптимум их активности находится в зонекислых рН (от 3,0 до 4,0), молекулярные массы составляют от 30 до 45 кДа [41,42]. Молекулы аспартатных протеаз состоят из двух субъединиц в форме«лопастей», разделенных в области активного центра [43]. Аспарагиновая кислотаактивного центра находится внутри последовательности Asp-X-Gly, где Х можетбыть представлен серином или треонином в протеазах семейства пепсина иаланином в реннин-подобных протеазах [41]. Аспартатные протеазы обратимоингибируются пепстатином [12].Микробные аспартатные протеазы можно разделить на две группы: пепсинподобныепротеазы,продуцируемыеAspergillus,Penicillium,RhizopusиNeurospora, и ренин-подобные ферменты, продуцируемые Endothia и Mucor spp.,а именно Mucor miehei, M.

pusillus, и Endothia parasitica [3, 4, 28].По базе данных MEROPS аспартатные протеазы разделяют на 16 семейств,которые сгруппированы в 6 кланов. Самую большую группу аспартатных протеазобразует семейство пепсина (А1) [14]. Пепсин-подобные протеазы являютсяодноцепочечными двухдоменными ферментами, содержат около 330–350 а.о. иимеют сходную первичную структуру. Консервативный сегмент составляет до 5%последовательности аспартатных протеаз. Два консервативных участка содержатостатки аспарагиновой кислоты, находятся в активном сайте фермента ивключены в механизм катализа [44].

Аминокислотная последовательностьпепсинов начинается 30–35 остатками, за которыми следуют два гидрофобныхостатка. За гидрофобными остатками следует консервативная последовательностьAsp-Thr-Gly, присутствующая во всех аспартатных протеазах. Asp-Thr-Glyнаходится внутри большой «лопасти», известной как Psi-loop (петля). Черезпримерно 45 а.о. после Asp-Thr-Gly находится консервативный тирозин. Ещечерез 45 а.о. находится последовательность Leu-Gly-Ile, за которой следуют более2290 а.о. Далее последовательность в некоторой степени повторяется. Двагидрофобных а.о. снова встречаются перед последовательностью Asp-Thr-Gly.Перед последовательностью Leu-Gly-Asp – более 85 а.о.

От 20 до 30 аминокислотсоставляют остальную часть первичной структуры пепсин-подобных протеаз [45,46]. Консервативный тирозин имеет большое значение, т.к. помогает определятьактивные сайты, где происходит связывание с субстратом. В последовательностяхLeu-Gly-Ile и Leu-Gly-Asp присутствует глицин, так как, ввиду структурныхособенностей, он может легко пройти через Psi-loop. Благодаря громоздкостиостатков лейцина, изолейцина и аспарагиновой кислоты, Psi-loop закреплена наместе [47].Пепсин, как и другие аспартатные протеазы, наиболее часто синтезируется ввиде неактивного зимогена – пепсиногена, содержащего дополнительные 44 а.o.на N-конце белка [45].

Пропептид образует спиралевидную структуру, котораястабилизируется электростатическими силами за счет образования ионных пармежду основными а.о. пропептида и карбоксильными боковыми цепочкамипепсина. Пропептид ингибирует активность фермента, т.к. его сегмент блокируетдоступ к каталитическим аспарагинам в активном сайте. Удаление пропептидаприводит к образованию активного пепсина [48]. Потеря спиралевиднойструктуры также обычно приводит к активации зимогена [45]. При снижении рНпроисходит протонирование карбоксильных боковых цепочек, что приводит кразрушению комплекса и образованию активного фермента. Продолжительноевыдерживание пепсина в зоне низких рН приводит к необратимой активациифермента [48].Пепсин характеризуется широкой субстратной специфичностью и способенрасщеплять пептидные связи между гидрофобными а.о.

[49]. В результатегидролиза белковых субстратов пепсином образуются, преимущественно, мелкиепептиды от 3 до 30 а.о. Несмотря на широкую специфичность, пепсин даетвоспроизводимый выход продуктов, т.е. при одинаковых условиях гидролизабелка образуются одинаковые пептиды. С наибольшей скоростью пепсин23гидролизует пептидные связи, образованные ароматическими а.к. – тирозином,триптофаном и фенилаланином [42, 45, 50].1.2Применение протеолитических ферментов при гидролизерастительного белоксодержащего сырья1.2.1 Основные виды белоксодержащего растительного сырьяРастительный белок имеет высокую биологическую ценность благодарясвоим питательным свойствам и низкому содержанию жира [51].

Растенияобладают способностью к быстрому воспроизводству за счет фотосинтеза, чтоделает их перспективным источником пищевого и кормового белка [52].В настоящее время, основным промышленным источником растительногобелка остается соя [53]. Второе место занимает пшеница, далее следуют другиезерновые, зернобобовые и масличные культуры. Значение пшеницы в пищевойпромышленности и кормопроизводствебудет возрастать,поскольку онапредставляет собой питательную и экономически выгодную продовольственнуюкультуру, адаптированную к различным климатическим условиям и типам почвы[54].1.2.1.1 Характеристика зернового сырьяСтроение зернаЗерно различных злаков имеет сходный анатомический и химическийсостав. Соотношение частей зерна пшеницы (рисунок 3) составляет (% от массы):зародыш – 2–4, плодовые и семенные оболочки – 10–17, эндосперм – 80–85 [55].Оболочки (внешние слои зерна) состоят из нескольких слоев, которыезащищают основную часть зерна от внешних воздействий среды и делятся наплодовую (околоплодник) и семенную.

Плодовые оболочки, образовавшиеся изстенок завязи, состоят из нескольких слоев клеток: наружный слой – эпикарпий24(продольные клетки), мезокарпий (поперечные клетки) и эндокарпий (трубчатыеклетки). В целом масса плодовых оболочек составляет 4–6% от веса зерна. Подплодовыми оболочками лежат семенные оболочки, которые состоят из двух слоевклеток: верхний (пигментный) и внутренний (гиалиновый).

Семенные оболочкиотносительно легки, масса их составляет 2–2,5% от всего зерна [55, 56].Рисунок 3 – Строение зерна пшеницы (адаптировано из [56])Подоболочкамирасположенэндосперм.Наружныйэндосперм–алейроновый слой, состоит из резко очерченных, крупных клеток кубическойформы с сильно утолщенными стенками. Алейроновый слой у одних культур(пшеница, рожь, овес) состоит из одного ряда, у других (ячмень) – из несколькихрядовклеток[55].Расположенныеподалейроновымслоемкрупныетонкостенные клетки разнообразной формы занимают всю внутреннюю частьэндосперма.