Диссертация (Создание новых комплексных ферментных препаратов грибных протеаз на основе штамма Penicillium canescens для эффективной конверсии белоксодержащего растительного сырья), страница 2

Для его эффективной конверсии широкоиспользуютсяпротеолитическиеферментныепрепараты(ФП),однакобольшинство из них выпускаются зарубежными производителями. Применениепротеаз с различной специфичностью действия позволяет повысить пищевую икормовую ценность сырья, улучшить его технологические свойства, повыситькачество и увеличить выход готовой продукции, а также снизить еесебестоимость [2–4].Однимизкрупномасштабных потребителейферментовмикробногопроисхождения является спиртовая отрасль, перерабатывающая более 2 млн.

тоннзерна в год [5]. Перспективным направлением интенсификации спиртовогопроизводства является гидролиз зернового белка. Обработка сусла кислымипротеазамиповышаетатакуемостькрахмала6зернаамилолитическимиферментами за счет разрушения углеводно-протеиновых связей и обеспечиваетдрожжилегкоусвояемымазотистымпитанием.Использованиекомплексагрибных протеаз эндо- и экзодействия позволяет сократить время сбраживания иснизитьстепеньбелковогозагрязненияоборудования.Такимобразом,применение протеаз позволяет интенсифицировать процесс дрожжегенерации иброжения, что способствует увеличению выхода этилового спирта, в том числе,пищевого [5, 6].В последнее время активным потребителем микробных протеаз такжестановится рынок кормовых ферментов. Использование ФП протеолитическогодействия позволяет заменять дорогостоящие компоненты кормовых рационовболее дешевыми зерновыми и бобовыми культурами, повышает питательнуюценность и усвояемость кормов, облегчает соблюдение санитарно-гигиеническихнорм их содержания и повышает продуктивность животных.

Применениепротеолитических ферментов позволяет снизить затраты на производство мясасельскохозяйственных животных и птицы, повысить конкурентоспособностьпродукции [7, 8]Перспективнымипротеолитических ФП,продуцентамивтомчисле,коммерческихаспартатных(кислых)комплексныхпротеазиэкзопептидаз, являются мицелиальные грибы, которые характеризуются высокойпродуктивностью и способностью к синтезу широкого спектра гидролитическихферментов при культивировании на относительно дешевых ферментационныхсредах, что существенно удешевляет процесс получения ФП. В настоящее времяна российском рынке ассортимент отечественных ФП грибных протеаз ограниченв связи с их высокой стоимостью – для организации рентабельного производстватаких ФП необходимы высокоактивные штаммы-продуценты, способные кбиосинтезу требуемого комплекса целевых ферментов [9, 10].В данной работе для получения высокоактивного рекомбинантногопродуцента комплекса протеолитических и сопутствующих ферментов былиспользован штамм-реципиент Penicillium canescens RN3-11-7 niaD-, ранееуспешно применявшийся для получения высокоактивных рекомбинантных7продуцентов карбогидраз в ФИЦ Биотехнологии РАН [11].

Следует отметить, чтоэтот штамм синтезирует собственный комплекс гемицеллюлаз, в первую очередь,ксиланазу и β-глюканазу, что является дополнительным преимуществом приобработке растительных субстратов, в частности, в пищевых производствах.Работапосвященасозданиювысокоактивныхпродуцентовпротеолитических ферментов на основе штамма P. canescens RN3-11-7 niaD-,обладающего собственной гемицеллюлолитической активностью, что позволитполучить конкурентоспособные комплексные ФП для повышения эффективностибиотехнологических процессов переработки растительного белоксодержащегосырья в пищевой и кормовой отраслях агропромышленного комплекса (АПК).Целью данной работы была интенсификация технологических процессов иповышение выхода и качества продукции пищевой (спиртовой) промышленностиидругих отрасляхАПКзасчетпримененияполученных наосновевысокоактивных рекомбинантных штаммов P. canescens новых отечественныхкомплексных ФП, содержащих протеазы с широкой специфичностью действия, атакже гемицеллюлазы.В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи: Осуществить трансформацию штамма-реципиента P.

canescens RN3-11-7niaD- плазмидами, несущими гены кислой аспартатной протеазы, грибнойсериновой протеазы и лейцинаминопептидазы. Провестискринингтрансформантов,выделитьихвысокоактивныеварианты. Получить на основе новых штаммов комплексные препараты протеаз игемицеллюлаз и изучить их свойства и компонентный состав. Провести производственные испытания по наработке промышленных ФПна основе новых штаммов. Исследовать гидролитические свойства новых ФП по отношению кразличнымвидамбелоксодержащегорастительногосырьядляинтенсификации технологических стадий спиртового и других производствза счет использования новых ФП.8Научная новизна.

Впервые для получения новых продуцентов протеаз длятрансформации реципиентного штамма P. canescens RN3-11-7 niaD- былиуспешно использованы векторные конструкции, содержащие гены ферментовпротеолитического комплекса – кислой аспартатной протеазы, сериновойпротеазы и лейцинаминопептидазы.Впервые методами генной инженерии получены новые продуцентыкомплексных ФП протеолитического и гемицеллюлолитического действия.Изучены физико-химические свойства новых комплексных препаратовпротеаз и гемицеллюлаз, компонентный состав этих препаратов, а также ихэффективность при обработке различных видов белоксодержащего растительногосырья в опытах in vitro и in vivo.Научно-практическаязначимостьработы.Созданыновыерекомбинантные продуценты на основе штамма-реципиента P. canescens RN3-117 niaD-, обеспечивающие получение высокоактивных комплексных ФП сширокойспецифичностьюдействия,обладающихразличнымивидамипротеолитической и гемицеллюлолитической активности.Проведено успешное внедрение технологии производства комплексных ФПи получены промышленные партии ФП с использованием новых рекомбинантныхштаммов P.

canescens – продуцентов протеаз и гемицеллюлаз в условиях заводаООО «Агрофермент» (Тамбовская обл.). На основании результатов лабораторныхиспытаний эффективности действия новых ФП на белоксодержащее растительноесырье показана перспективность применения протеолитического комплекса вспиртовой промышленности, а также в качестве кормовых добавок длясельскохозяйственных животных и птицы.Полученные результаты имеют большое практическое значение дляосуществления промышленного производства отечественных ФП и обеспеченияэффективного импортозамещения в пищевой промышленности и других отрасляхАПК.9Показана эффективность нового комплексного препарата, содержащегоэндо- и экзопептидазы, при сбраживании пшеничного сусла в производствеэтанола в результате интенсификации процесса дрожжегенерации.Проведены успешные испытания промышленных партий комплексных ФПв условиях племзавода «Орловский» (Тамбовская обл.) в составе комбикормовпри откорме свиней.

Показано положительное влияние кормовых добавок напродуктивность,физиологическоесостояниеживотныхикачественныепоказатели мяса и шпика, а также на увеличение прибыли.Научно-практическая новизна технических решений подтверждена 2патентами РФ.Основные положения диссертации, выносимые на защиту:1.Созданыметодамигенетическойинженерииновыестабильныевысокоактивные рекомбинантные штаммы-продуценты грибных протеаз сразличной специфичностью действия: P. canescens Pep-4 – продуцент кислойаспартатнойпротеазы–пенициллопепсина;P.canescensRN3-11-7-7–пенициллопепсина и лейцинаминопептидазы; P.

canescens Oryzin-25 – грибнойсериновой протеазы – оризина. Новые штаммы характеризуются тем, что базовыйуровень биосинтеза собственного комплекса гемицеллюлаз штамма P. canescensпрактически не изменился.2. Технология производства комплексных ФП протеаз и гемицеллюлазуспешно масштабирована в условиях завода ООО«Агрофермент», чтообеспечило получение промышленных партий этих ФП.3.Новыештаммы-продуцентыпозволилиобеспечитьсодержаниерекомбинантных протеаз в промышленных ФП ПЕП (пенициллопепсин) и ПЕПЛАП (пенициллопепсин и лейцинаминопептидаза) и лабораторном ФП Оризин20–25% от общего пула белка, ксиланазы – 15–20%, α-L-арабинофуранозидазы иарабиноксилан-арабинофураногидролазы – 25–30%, β-1,3-глюканазы – 2–5%, т.е.получить комплексные ФП, в состав которых входят протеазы и гемицеллюлазы.4.

ФП протеолитического действия ПЕП-ЛАП (пенициллопепсин илейцинаминопептидаза) успешно использован для интенсификации процесса10дрожжегенерации спиртового производства и увеличения выхода спирта изпшеничного сусла по сравнению с контролем.5. Комплексные ФП протеаз и гемицеллюлаз успешно использованы вкачестве кормовых добавок для откормочного молодняка свиней.Соответствиедиссертациипаспортунаучнойспециальности.Диссертация соответствует пунктам 4, 7 и 15 паспорта специальности 05.18.07 –«Биотехнология пищевых продуктов и биологически активных веществ».СтепеньдостоверностидиссертационногоисследованияДостоверностьрезультатов.исделанныхвыводоврезультатовподтверждаетсяиспользованием современных методов исследований, которые соответствуютпоставленным в работе целям и задачам.

Научные положения, выводы ирекомендации, сформулированные в диссертации, подкреплены данными,представленными в таблицах и рисунках. Статистическую обработку данныхпроводили с доверительной вероятностью 0,95 в программе Microsoft Office Excel.Личный вклад диссертанта. Автор лично проводил сбор и анализлитературных данных, осуществлял планирование и проведение научныхэкспериментов, обработку и интерпретацию полученных данных, а такжеподготовку материалов научных публикаций.Апробация результатов работы.

Результаты работы представлены нароссийских и международных конференциях и симпозиумах: 7 и 8 Московскихмеждународных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития»(Москва, 2013, 2015); International Conferences «Biocatalysis-2013» и «Biocatalysis2015: fundamentals and applications» (Москва, 2013, 2015); II Всероссийскойнаучно-практической конференции молодых ученых и аспирантов «НаучноеобеспечениеинновационныхсельскохозяйственнойМеждународномитехнологийпищевойпроизводствапродукции»научно-практическоми(Краснодар,симпозиумехранения2014);VII«Перспективныебиотехнологические процессы в технологиях продуктов питания и кормов»(Москва,2014);IXМеждународнойнаучнойконференции«Микробныебиотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Минск, 2015); 8-м11Международном научно-практическом симпозиуме «Перспективные ферментныепрепараты и биотехнологические процессы в технологиях продуктов питания икормов» (Москва, 2016); V съезде физиологов СНГ и V съезде биохимиковРоссии (Дагомыс, 2016); V международной научно-практическая конференция«Биотехнология: наука и практика» (Ялта, 2017); Научно-практическом семинаре«Современные биотехнологические процессы, оборудование и методы контроля впроизводстве спирта и спиртных напитков» (Москва, 2017).Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 17 печатныхработ, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК РФ, 2 статьи вдругих научных изданиях, а так же 6 тезисов и 5 статей в сборниках материаловконференций, получено два патента РФ.121 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ1.1 Протеолитические ферментыПротеолитическиеферментыклассифицируютпотремосновнымкритериям: по типу катализируемой реакции; по механизму катализа в активномцентре; по гомологии аминокислотной (а.к.) последовательности каталитическогодомена, отражающей эволюционное родство. Комитетом по номенклатуреМеждународного союза биохимиков и молекулярных биологов (NC-IUBMB)принят основной принцип классификации ферментов – тип катализируемойреакции [12].В классификации ферментов, выделен класс гидролаз КФ 3, к подклассу КФ3.4 которого относятся все протеолитические ферменты, или протеазы (они же –протеиназы, устаревшее название).

Протеазы – ферменты гидролитическогодействия, катализирующие гидролиз белков и пептидов за счет расщепленияпептидных связей. Протеазы разделяются на 14 субподклассов по типукатализируемых реакций (таблица 1), объединённые в две большие группы:экзопептидазы, расщепляющие пептидную связь только в концевых областяхполипептида (субподклассы КФ 3.4.11-19), и эндопептидазы, действующие насвязи внутри полипептидной цепочки (субподклассы КФ 3.4.21-24 и КФ 3.4.99)[12, 13].Таблица 1 – Классификация протеаз по типу катализируемой реакции [10]Индекс КФГруппа протеазЭкзопептидазы3.4.11Аминопептидазы3.4.13Дипептидазы3.4.14Дипептидил-пептидазы13Механизм действияДействуют на N-конецполипептидной цепи, высвобождаяаминокислотный остатокДействуют только на дипептидыДействуют на N-конецполипептидной цепи, высвобождаядипептидИндекс КФГруппа протеазМеханизм действияТрипептидил-пептидазы3.4.15Пептидил-дипептидазы3.4.16Карбоксипептидазы(сериновые)3.4.17Металлокарбоксипептидазы3.4.18Карбоксипептидазы(цистеиновые)3.4.19ОмегапептидазыДействуют на N-конецполипептидной цепи, высвобождаятрипептидДействуют на С-конецполипептидной цепи, высвобождаядипептидДействуют на С-конецполипептидной цепи(Содержат серин в активном центре)Действуют на С-конецполипептидной цепи(Протеазы, содержащие в активномцентре ионы металлов)Действуют на С-конецполипептидной цепи(Содержат цистеин в активномцентре)Высвобождают модифицированныеконцевые остаткиЭндопептидазы3.4.213.4.223.4.233.4.243.4.253.4.99Действуют на связи внутриполипептидной цепи(Содержат серин в активном центре)Действуют на связи внутриЦистеиновыеполипептидной цепи(Содержатцистеин в активномэндопептидазыцентре)Действуют на связи внутриполипептидной цепиАспартатные эндопептидазы(Содержат аспартат в активномцентре)Действуют на связи внутриполипептидной цепиМеталлоэндопептидазы(Протеазы, содержащие в активномцентре ионы металлов)Действуют на связи внутриТреониновыеполипептидной цепи(Содержат треонин в активномэндопептидазыцентре)Сериновые эндопептидазыЭндопептидазы снеизвестным механизмомкатализа14-Существует альтернативная классификация протеаз по базе данныхMEROPS, которая была основана в 1993 году и создана, как база данных винтернете в 1996 году [14].