Диссертация (Физико-химические свойства и структура пленок Ленгмюра-Блоджетт, содержащих ионы переходных металлов), страница 13

Но они демонстрируют низкуюмеханическую прочность и, следовательно, не могут быть использованы всистемах высокого давления. Напротив, неорганическая матрица, такая какдиоксид кремния, обладает превосходными механическими свойствами, ноимеет недостаток в виде необратимой неспецифической сорбции белков[167].Исследования с использованием хелатных сорбентов в основномнаправлены на обогащение биологических проб фосфорсодержащимипептидами [168-172], а также очистке различных производных ДНК,олигонуклеотидов, белков, меченных остатками гистидина [173, 174].

Niсодержащий сорбент имеет чрезвычайно высокое сродство к гистидину, наэтом основан метод препаративной очистки рекомбинантных белков,меченых гистидином. Хелатные сорбенты, как и оксидные, позволяют ввысокой степени селективно выделять фосфорсодержащие пептиды и белки.Однако, имеет место и неспецифичная сорбция примесей, подавить которуюполностью не удается, а также возможность вымывания металла из сорбентаво время элюирования. Кроме того, для работы с такими сорбентаминеобходимо дополнительное оборудование (спиновые колонки, качающаясяплатформа). Немаловажным фактором является и высокая стоимость такихсорбентов.К настоящему времени известно об использовании в качестветвердотельных металл-аффинных сорбентов оксидов многих металлов.Самым распространенным является оксид титана TiO 2, которому посвященобольшое число работ по оптимизации условий проведения анализа [175-178],также много внимания уделено оксиду циркония ZrO 2 [179, 180]. Былипредприняты успешные попытки использовать в качестве сорбента дляобогащения фосфорилированных пептидов гидроксид алюминия Al(OH) 388[181], оксид галлия Ga2O3 [182], оксид ниобия Nb2O5 [183], оксид олова SnO2,который показал более низкий уровень неспецифического связывания посравнению с TiO2 [184], оксид тантала Ta2O5 [185].

Также перспективнымследует признать использование оксида железа как в варианте магнитныхшариков Fe3O4 [186], так и микроразмерного Fe2O3 [187]. Метод такназываемой металлоксидной аффинной хроматографии (МОАХ) имеетбольшое значение в фосфопротеомных исследованиях для выделенияфосфорсодержащихпептидовбездополнительныхпроцедурпробоподготовки, таких как этерификация и ионообменная хроматография[188].На сегодняшний день наиболее активно и плодотворно возможностиметалл-аффинной хроматографии используют в протеомных исследованиях,в которых снижение сложности (компонентности) системы являетсянеобходимымусловиемприанализеиидентификациималораспространенных белков [189]. МАХ прочно заняла свое место средидругих методов предварительного разделения сложных смесей, таких какжидкостная обращенно-фазовая, ионообменная, аффинная хроматографии игель-электрофорез [190, 191].

В зависимости от целей и задач, в процессепробоподготовки МАХ комбинируют с двухмерным гель-электрофорезомпри анализе белков, или с обращенно-фазовой хроматографией длядополнительного разделения пептидов.В протеомикеметалл-аффиннуюхроматографиюиспользуютвисследованиях, где фракции клеточного белкового пула обогащают длядальнейшего анализа. Так, например, белки со сродством к металлам могутбыть обогащены либо с учетом их способности связываться с определеннымиммобилизованным ионом металла (например, M 2+-NTA), либо путемсвязывания иона металла с белком (М 2+-белок) на металл-аффинном лиганде(например, NTA) [192,193].

В качестве ионов, пригодных для металлаффинного анализа металлопротеома чаще всего используют Cu2+, Ni2+, Zn2+.Но основным протеомным приложением МАХ является фосфопротеомика,89занимающаяся анализом такой посттрансляционной модификации белков,как фосфорилирование [192]. Обратимое фосфорилирование белков поостаткам серина, треонина и тирозина имеет важное биологическое значение.Какправило,ферментативноефосфорилирование/дефосфорилированиеклеточных белков контролирует ключевые внутриклеточные процессы,связанные с делением, дифференцировкой или гибелью клеток. Активноразвиваемаяотрасльподобныхисследований–изучениепуламодифицированных белков при различных клеточных состояниях–позволяет вычленять ключевое событие в каскаде фосфорилированийдефосфорилирований.Металл-аффинная хроматография была предложена как относительнопростой, экономичный и универсальный метод выделения различных типовфосфорилированных пептидов [194-196] и быстро нашла свое применение висследованиях фосфопротеома [197, 198].

Как было указано выше, самымираспространеннымихелатирующимилигандамивметалл-аффинныхсорбентах являются нитрилотриуксусная (NTA) и иминодиуксусная (IDA)кислоты. Эти кислоты хелатируют ионы Ni2+, Zn2+, Fe3+, Ga3+ и другие[195,199-201], при этом свободные орбитали атомов металлов способныучаствоватьвкоординационномвзаимодействиисотрицательнозаряженными пептидами, в частности с фосфорилированными пептидами.Было отмечено, что сорбент на основе Fe3+-NTA показывает более высокуюселективность к фосфорилированным пептидам по сравнению с Fe 3+-IDA[196].

Однако, серьѐзным недостатком метода МАХ является неспецифичноесвязывание с сорбентом таких кислых аминокислот, как глутаминоваякислота, аспарагиновая кислота, гистидин и цистеин, и других отрицательнозаряженныхсоединений.предпринимаютсяпопыткиНапротяженииуменьшитьпоследнихдесятилетийнеспецифическуюсорбциюразличными способами [202]. Так, можно варьировать рН раствора, вкотором происходит связывание (связывающий буфер) [195, 199] или рНпромывочного раствора [200, 201]. Несмотря на успешное применение этого90подхода на стандартных белках, при переходе на уровень протеомаселективность метода снижается до 60-70%, что приводит к недостаточноэффективной идентификации фосфорилированных белков. Альтернативно,возможно использование реакции этерификации для получения метиловыхэфиров пептидов, что позволяет определять большее числосайтовфосфорилирования в сложных биологических смесях [200, 202-204]. Однаковведение дополнительной реакции может привести к большим потерям вобразце [205, 206].Были разработаны методики предварительной очистки образцовкатион- или анионообменной хроматографией [207, 208].

Такой подходпозволил увеличить селективность МАХ до 75%. Однако, к недостаткамтакого метода можно отнести возможность слишком сильного удерживаниянеполностьюферментативногидролизованныхпептидов,атакжезначительное удерживание других модифицированных пептидов, например,N-ацетилированных пептидов и гликопептидов. Кроме того, было показано,что нормальнофазовая хроматография в качестве предварительного этапапробоподготовки,можетбытьэффективнаприфосфопротеомнойидентификации [209].

Поскольку фосфатная группа является сильногидрофильной, фосфорилированные пептиды слабо удерживаются нанормальной фазе, что приводит, после металл-аффинного обогащения, к 99%селективности.На сегодняшний день наиболее успешным оказалось применениеметода МОАХ на основе оксида титана TiO 2. При использованиипредколонки с TiO2, соединенной с обращенно-фазовой капиллярнойколонкой,авторами[210]былапоказанавозможностьизвлеченияфосфорилированных пептидов казеина из гидролизата суммарного белкамолока коровы. Однако селективность этого метода была снижена из-занеспецифического связывания кислых нефосфорилированных пептидов. Вработе [211] авторы использовали 2,5-дигидроксибензойную кислоту вкачестве добавки в раствор, в котором проходит сорбция, для удаления91неспецифично связавшихся пептидов, что повысило селективность ичувствительностьметода.Вработе[212]былавпервыепоказанавозможность применения оксида циркония при МОАХ, причем ZrO2 имеетбольшую селективность к монофосфорилированным пептидам, тогда какTiO2 – к мультифосфорилированным.

Был сделан вывод, что комбинациядвух сорбентов имеет потенциал для исчерпывающего профилированияфосфопротеома [213]. При добавлении в связывающий и промывочныйбуферы молочной кислоты, в элюате после МОАХ на TiO 2 содержится, какправило, более 90% фосфорилированных пептидов, для ZrO2 это значениениже [214].Сорбенты на основе оксидов металлов могут быть использованы вразличном аппаратурном исполнении. Наиболее распространен «off-line»вариант,обеспечивающийгибкостьвподборерастворителейимасштабируемости эксперимента. Частицы оксидов металлов могут бытьупакованы в носики для автоматических пипеток (сорбция достигается путеммногократного пропускания образца через сорбент) [215], либо помещены вспиновые колонки (образец пропускают через сорбент с помощьюцентрифуги).