Диссертация (Хромосомная, клеточная и тканевая специфичность гидроксиметилирования ДНК в проэмбриональный и эмбриональный периоды развития человека), страница 5

Репарация образовавшегося АП-сайтаприводит к замещению 5-формилцитозина/5-карбоксилцитозина цитозином (рис. 2).Другие ДНК гликозилазы – SMUG1 и MBD4 – не обладают способностью краспознаванию и эксцизии 5-формилцитозина и 5-карбоксилцитозина из ДНК (He et al.,2011; Maiti, Drohat, 2011). Распознавание и удаление 5-формилцитозина гликозилазойTDG происходит с очень высокой скоростью, примерно на 40% быстрее, чем его«mismatch» репарация. При этом гликозилаза TDG не обладает активностью в отношении5-метилцитозина и 5-гидроксиметилцитозина (Zhu et al., 2000; Maiti, Drohat, 2011), что,возможно, объясняет снижение уровня 5-формилцитозина и 5-карбоксилцитозина посравнению с 5-гидроксиметилцитозином в геноме млекопитающих.

Делеция гена,кодирующегоTDGумышей,приводиткаберрантномуповышениюуровняметилирования ДНК в промоторах ряда генов и к ранней эмбриональной гибели (Cortazaret al., 2011; Cortellino et al., 2011).Таким образом, в процессе активного деметилирования принимают участие трисемейства белков: ТЕТ, AID/APOBEC и гликозилазы, участвующие в эксцизионнойрепарацииДНК.Взависимостиотзадействованныхферментовактивноедеметилирование может осуществляться по-разному (рис.

2). Первый путь заключается впоследовательном преобразовании белками семейства ТЕТ 5-метилцитозина в 5гидроксиметилцитозин, 5-формилцитозин и, наконец, в 5-карбоксилцитозин. В результатезапускается механизм эксцизионной репарации с участием гликозилаз TDG и SMUG, и 5карбоксилцитозин вырезается из цепи ДНК (рис. 2) (He et al., 2011; Ito et al., 2011).Во втором пути активного деметилирования задействовано семейство белковAID/APOBEC. Они осуществляют дезаминирование 5-метилцитозина, в результате чегообразуется тимин, который затем гликозилазами TDG и SMUG заменяется на цитозин(рис.

2) (Bhutani et al., 2011).20Третий способ активного деметилирования реализуется при участии всех трёхбелковых семейств. 5-гидроксиметилцитозин, образовавшийся в результате действиябелков ТЕТ, подвергается воздействию дезаминаз AID/APOBEC. Это приводит кобразованию 5-гидроксиметилурацила, который, в свою очередь, заменяется на цитозинвследствие эксцизионной репарации (рис. 2) (Bhutani et al., 2011).Как стабильное основание, 5-гидроксиметилцитозин может оказывать влияние наструктурухроматинаилокальнуютранскрипционнуюактивность.5-гидроксиметилцитозин способен «выключать» метил-CpG-связывающиеся белки (MBPs),которые распознают 5-метилцитозин. Показано, что метил-связывающий белок MeCP2 нераспознаёт 5-гидроксиметилцитозин (Valinluck et al., 2004).

Кроме того, преобразование 5метилцитозинав5-гидроксиметилцитозинможетспособствоватьпассивномудеметилированию ДНК при отсутствии метилтрансферазы DNMT1, которая плохо узнаёт5-гидроксиметилцитозин (Valinluck et al., 2007).Рисунок 2. Механизмы пассивного и активного деметилирования ДНК.

Примечание:синиестрелки–белкиTETгидроксилируют5-метилцитозин(5mC)до5-гидроксиметилцитозина (5hmC), который окисляется до 5-формилцитозина (5fC) и, затем,до5-карбоксилцитозина(5caC),сиреневыестрелки–5-метилцитозини5-гидроскиметилцитозин дезаминируются семейством белков AID/APOBEC и образуюттимин (Thy) и 5-гидроксиметилурацил (5hmU), соответственно, зеленые стрелки –гликозилазыTDG/SMUG1замещаютпромежуточныесоединения–тимин,5-гидроксиметилурацил и 5-карбоксилцитозин – на цитозин (Cyt) в процессе эксцизионнойрепарации оснований (BER) (по Bhutani et al., 2011).21Таким образом, активное деметилирование ДНК представляет собой сложныймногостадийный процесс, в котором принимают участие различные семейства ферментов.Опосредованное белками семейства ТЕТ окисление 5-метилцитозина инициирует каскадреакций, приводящих к динамическим изменениям метилирования ДНК.

Превращение 5метилцитозинавцитозинврезультатеегопоследовательногоокислениядокислородсодержащих производных (5-гидроксиметилцитозина, 5-формилцитозина и 5карбоксилцитозина) является основным механизмом активного деметилирования ДНК.1.4.Динамикаизменений5-гидроксиметилцитозинаприэпигенетическомрепрограммировании генома млекопитающихВ онтогенезе млекопитающих дважды – в процессе дифференцировки половыхклетокивдоимлантационномрепрограммированиегенома,котороеразвитии–происходитсопровождаетсяэпигенетическоеглобальнымиизменениямихарактера метилирования ДНК. В ходе репрограммирования происходит стираниесуществующего рисунка метилирования за счёт деметилирования ДНК и установлениенового путём реметилирования (метилирования de novo).

Деметилирование ДНК можетпроисходить двумя способами: пассивно и активно. Пассивный механизм реализуетсяпосле репликации ДНК при отсутствии метилазной активности. В этом случаеновосинтезированная нить ДНК не метилируется по образцу старой. При этом образуетсяполуметилированная или так называемая гемиметилированная ДНК. В процессеактивного деметилирования превращение 5-метилцитозина в цитозин осуществляетсянезависимо от репликации ферментативными системами, в том числе белками ТЕТ иДНК-гликозилазами (Bhutani et al., 2011).ДНК первичных половых клеток (ППК) человека гиперметилирована. Первыйраунд деметилирования ДНК происходит во время миграции первичных половых клеток(ППК) в мезенхиму половых валиков формирующейся гонады (Carlson, 2009).

Ролькислородсодержащих производных 5-метилцитозина в процессе деметилирования геномадифференцирующихся гамет изучена только на мышах. В ППК мышей снижение уровняметилирования ДНК начинается на 8 сутки (Е8.0) (Saitou et al., 2012). Потеря 5метилцитозина происходит пассивно (Guibert et al., 2012; Seisenberger et al., 2012;Kagiwada et al., 2013). Она не сопровождается появлением 5-гидроксиметилцитозина и независит от белков семейства ТЕТ (Yamaguchi et al., 2012). Снижение глобального уровняметилирования продолжается до стадии E9.0 (Guibert et al., 2012; Seisenberger et al., 2012).Несмотря на то, что в ППК активно экспрессируется ген метилтрансферазы Dnmt1 в этотпериод, восстановление метилирования не происходит, т.к.

не экспрессируется ген22необходимого кофактора Uhrf1 (Kurimoto et al., 2008). При дальнейшем деметилированиивгеномеППКрегистрируютпрогрессивноеувеличениеколичества5-гидроксиметилцитозина. Пик содержания 5-гидроксиметилцитозина в ППК приходится на10-11 сутки (Е10.75). Начиная с 11-12 суток (Е11.5), уровень 5-гидроксиметилцитозинаснижается.

При этом не наблюдается увеличения количества 5-формилцитозина и 5карбоксилцитозина (Yamaguchi et al., 2013). Завершающим этапом деметилирования ДНКППК мышей является зависимая от репликации потеря 5-гидроксиметилцитозина,происходящая на 10-13 сутки (Е10.5-Е13.5) (Seisenberger et al., 2012; Yamaguchi et al.,2013). 5mC и 5hmC достигают минимального значения на стадии E13.5 (Guibert et al.,2012; Saitou et al., 2012; Seisenberger et al., 2012; Yamaguchi et al., 2013). Деметилированиеимпринтированных генов в ППК идёт с задержкой. Оно начинается после E9.5 изавершается после E13.5 (Guibert et al., 2012; Kagiwada et al., 2013; Kobayashi et al., 2013).В этом задействованы как пассивный, так и активный механизмы.

Пассивная потеря 5mCначинается с E9.5 (Kagiwada et al., 2013), а активное деметилирование при участиифермента TET1 запускается на E10.5 (Hackett et al., 2013; White et al., 2016).Деметилирование импринтированных генов в женских ППК завершается к 16 неделеразвития, а в мужских – только к 20 неделе (Gkountela et al., 2015). Реметилирование ДНКмужских и женских половых клеток запускается в разное время. В мужских половыхклетках метилирование de novo начинается в E13.5, в пресперматогониях или гоноцитах,которые задерживаются в митозе, и это метилирование сохранятеся вплоть до рождения(Kato et al., 2007; Seisenberger et al., 2012). Напротив, метилирование de novo женскихгамет не инициируется до рождения (Smallwood et al., 2011). Характер метилированиягеномов зрелых мужских и женских гамет сопоставим с таковым в соматических клетках.Исключение составляют только центры импринтинга, эпигенетические метки которыхустанавливаются в соответствии с полом особи (Kobayashi et al., 2013).ВторойраунддеметилированияДНКначинаетсявзиготесразу послеоплодотворения и продолжается в течение всего доимплантационного периода, вплоть достадии бластоцисты (Beaujean et al., 2004; Fulka et al., 2004; Iurlaro et al., 2017; Zhu et al.,2018).Сопоставлениестепениметилированияродительскихпронуклеусовигомологичных метафазных хромосом в зиготах некоторых млекопитающих, в том числечеловека, показало гипометилирование или отсутствие метилирования отцовского геномапри сохранении высокого уровня 5-метилцитозина в материнском геноме (Beaujean et al.,2004; Fulka et al., 2004; Баранов и др., 2005; Xu et al., 2005; Pendina et al., 2011; Zhu et al.,2018).

Разное содержание 5-метилцитозина в родительских геномах на стадии зиготы23связано с активным деметилированием отцовской ДНК, происходящим практически сразупосле оплодотворения.Высокий уровень содержания 5-гидроксиметилцитозина в мужском пронуклеусебыл показан в зиготах млекопитающих – кроликов, мышей и коров (Iqbal et al., 2011;Wossidlo et al., 2011). Появление в мужском пронуклеусе 5-гидроксиметилцитозинасовпадает с началом понижения уровня 5-метилцитозина (Iqbal et al., 2011; Wossidlo et al.,2011). Вероятно, деметилирование ДНК с образованием 5-гидроксиметилцитозина какпромежуточногопродуктаявляетсяэволюционноконсервативныммеханизмомрепрограммирования генома.Деметилирование мужского генома катализируется белком TET3, большиеколичества которого обнаружены в ооцитах и зиготах.

Содержание ТЕТ3 резко снижаетсяна стадии двух бластомеров и при последующих делениях дробления (Iqbal et al. 2011;Wossidlo et al., 2011). Делеция гена Теt3 в ооцитах или его инактивация с помощью малыхинтерферирующихРНК(siRNA)взиготепрепятствуетобразованию5-гидроксиметилцитозина из 5-метилцитозина в мужском пронуклеусе (Gu et al., 2011;Wossidlo et al., 2011). Предполагают, что содержащийся в зиготе белок TET3 необходимдля активного деметилирования транспозонов Line1 и регуляторных районов геновплюрипотентности Oct4 и Nanog, гиперметилированных в сперматозоиде.