Диссертация (Хромосомная, клеточная и тканевая специфичность гидроксиметилирования ДНК в проэмбриональный и эмбриональный периоды развития человека), страница 3

Д.О.Отта».ПубликацииПо материалам исследования опубликовано 18 работ (7 статей и 11 тезисовконференций), в том числе 7 статей в изданиях, рекомендуемых ВАК.Работа выполнена в ФГБОУВО«Санкт-Петербургскийгосударственныйуниверситет» и ФГБНУ «НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О.Отта».11ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ1.1. Метилирование ДНКВ настоящее время изучению эпигенетических модификаций генома уделяетсяпристальное внимание в связи с их значительной ролью в процессах реализациинаследственной информации в онтогенезе (Ko et al., 2008; Shi et al., 2009).Эпигенетические модификации вызывают изменения экспрессии генов, которые могутнаследоваться в ряду митотических делений клетки, но при этом не происходитнарушения нуклеотидной последовательности ДНК. К эпигенетическим модификациямотносят метилирование цитозина ДНК, посттрансляционные модификации гистоновыхбелков, различные типы регуляторных и интерферирующих РНК (Holmquist, Ashley,2006).Метилирование ДНК является ключевой эпигенетической модификацией геномачеловека.

Метилирование – это обратимая модификация ДНК. Метилированиезаключается в присоединении метильной группы (-CH3) S-аденозилметионина к углеродув 5-ом положении молекулы цитозина с образованием 5-метилцитозина (Ванюшин, 2006;Senner, 2011) (рис. 1). Таким образом, метилирование цитозина – это химическаямодификация, не затрагивающая нуклеотидную последовательность ДНК. Метилированиегенома динамически изменяется в эмбриогенезе, когда оно необходимо для инактивацииX хромосомы и асимметричной экспрессии импринтированных генов (Reik, 2007).

Крометого, доказано участие метилирования ДНК в регуляции следующих биологическихпроцессов: экспрессии генов, ремоделировании структуры хроматина, обеспечениистабильности хромосом (Reik et al., 2001), репрессии мобильных элементов генома (Goll,Bestor, 2005).Рисунок 1. Схема метилирования цитозина.5-метилцитозин (5mC) – минорное основание, которое составляет около 1% от всехоснований ДНК млекопитающих.

Большая часть молекул 5mC находится в составединуклеотидов 5’-CpG-3’ (Ehrlich, Wang, 1981). Их небольшое число представлено в12последовательностях 5’-CpNpGp-3’ или ассиметричных последовательностях 5’-CpA-3’ и5’-CpT-3’ (Ramsahoye et al., 2000). В геномах млекопитающих, в том числе человека, 7080% молекул цитозина в составе CpG-динуклеотидов метилированы (Bird, 2002; Goll,Bestor, 2005). Уровень метилирования варьирует для клеток разных тканей, стадийразвития и участков ДНК.

Метилированные участки ДНК характерны для хроматина, всоставкотороговходитпозднореплицирующаясяДНК,труднодоступнаядлятранскрипционных факторов. Такие участки составляют около 98% генома, CрGдинуклеотиды расположены в них с частотой приблизительно 1:80. НеметилированныеCрG-динуклеотиды представлены, в основном, в районах ДНК протяженностью 500-5000п.н., называемых CрG-островками.

CpG-островки характерны для функциональноактивного хроматина, составляющего 1-2% генома. Плотность CрG-динуклеотидов в нихв пять раз больше, чем в среднем по геному. Хроматин СpG-островков характеризуетсяочень низким содержанием гистона Н1, гиперацетилированием гистонов Н1 и Н4,практически полным отсутствием нуклеосомной структуры в ДНК и слабой степеньюспирализации. Все эти особенности строения ДНК эухроматина свидетельствуют о егоактивном взаимодействии с транскрипционными факторами (Tazi, Bird, 1990).По некоторым оценкам в гаплоидном геноме человека насчитывается 25495 CрGостровков (Illingworth et al., 2010). Распределение CрG-островков соответствуетфункциональной организации хромосом. CрG-островки приемущественно расположены впромоторных областях и/или экзонах генов «домашнего хозяйства» (house-keeping genes)и некоторых тканеспецифичных генов (Consortium Ihgs, 2001; Venter et.

al., 2001;Illingworth et al., 2010). Таким образом, метилированные и неметилированные CpGдинуклеотиды располагаются в хромосомах неслучайным образом. При этом длябольшинства неметилированных участков хроматина свойственна преимущественнаялокализация в районах ДНК, содержащих гены, и специфичный нуклеотидный состав,характеризующийся высокой частой GC-пар (Musio et al., 2002).Метилирование ДНК катализируется особой группой ферментов – ДНКметилтрансферазами.

Описано 3 семейства ДНК-метилтрансфераз: DNMT1, DNMT2 иDNMT3 (Jurkowska et al., 2011). Основной функцией DNMT1 является поддержаниеметилированного состояния ДНК. Активность DNMT1 обнаруживается в фокусахрепликации в S-фазе клеточного цикла. При репликации полностью метилированной ДНКобразуется полуметилированная форма с неметилированной новосинтезированной цепью.DNMT1 метилирует остатки цитозина, расположенные во вновь синтезированной цепиДНК в соответствии с положение метилированных цитозинов старой цени. Такимобразом, после каждого раунда репликации фермент обеспечивает сохранение в дочерних13цепях ДНК родительского паттерна метилирования (Li et al., 1992).

Для работы DNMT1необходим кофактор UHRF1, который связывается с гемиметилированной ДНК во времяS-фазы и, таким образом, участвует в регуляции структуры хроматина и экспрессии генов.Экспрессия uhrf1 достигает максимума в конце фазы G1 и продолжается во время G2 и Mфазы клеточного цикла (Kurimoto et al., 2008).СубстратомдлясемействаДНК-метилтрансферазDNMT3служитнеметилированная ДНК (Okano et al., 1999). DNMT3a и DNMT3b обеспечиваютустановление специфичного рисунка метилирования de novo, необходимого дляобеспечения особых структурно-функциональных состояний хроматина в онтогенезе.Экспрессия генов этих ДНК-метилтрансфераз происходит, в основном, в эмбриональныхи половых клетках.

DNMT3L не обладает собственной каталитической активностью,однако может присоединять DNMT3a и DNMT3b к определенным последовательностямДНК путём распознавания нуклеосом, которые содержат неметилированные гистоныH3K4 (Bourc’his, Bestor, 2004; Ooi et al., 2007). Показано, что DNMT3a и DNMT3b имеюткроме метилтрансферазной ещё и дегидроксиметилазную активность и способныпревращать 5-гидроксиметилцитозин (5hmC) напрямую в цитозин in vitro.

В присутствииβ-меркаптоэтанола подавляется их дегидроксиметилазная активность, а в условияхокислительного стресса снижается метилтрансферазная активность (Chen et al., 2012).DNMT2 имеет слабую каталитическую активность. DNMT2 способна катализироватьметилирование цитозина в 38-м положении антикодоновой петли тРНК аспарагина (Gollet al., 2006).Метилирование ДНК у позвоночных связано в основном с регуляцией экспрессиигенов (Straussman et al, 2009).

Именно этим определяется неслучайность распределенияметилированных и неметилированных CpG-динуклеотидов в геноме.Предполагается существование двух различающихся механизмов блокированиятранскрипции посредством метилирования ДНК (Bird, Wolffe, 1999). Первый заключаетсяв том, что 5-метилцитозин ингибирует связывание некоторых факторов транскрипции(AP-2, E2F, NFkB) с последовательностями ДНК мишеней, содержащими CpGдинуклеотиды. Однако, следует отметить, что некоторые транскрипционные факторы нечувствительны к метилированию (Sp1, CTF) и могут связываться с участками ДНК, неимеющими CpG-динуклеотидов (Tate, Bird, 1993).Вреализациюметилированиевторогововлеченыбелкимеханизмаиблокированиябелковыекомплексы,транскрипциикоторыечерезспецифичносвязываются с метилированными CpG-динуклеотидами и ингибируют связываниефакторов транскрипции с ДНК (Hendrich, Bird, 2000).

Основную роль в этом играет14метилцитозинсвязывающий комплекс, состоящий из 5 основных белков: MBD 1-4 иMeCP2. Все белки этого комплекса, за исключением MBD4, выполняют функциюрепрессоров, меняющих структуру хроматина. Белок MBD4 участвует в репарации ипредотвращает мутационные изменения метилцитозина (Hendrich, Bird, 1998).Одним из примеров регуляции экспрессии генов с помощью метилирования ДHКявляется феномен геномного импринтинга (ГИ). Под геномным импринтингом понимаютразличную экспрессию генов в зависимости от их родительского происхождения.Молекулярную основу ГИ составляют эпигенетические изменения, дифференциальномаркирующие гомологичные гены материнского и отцовского происхождения, что иприводит к их разному фенотипическому проявлению.

В импринтированных участкахэкспрессируется только одна из двух аллелей – отцовская или материнская, тогда какэкспрессия второй, импринтированной аллели, подавлена. При этом экспрессияимпринтированного гена у потомка определяется его родительским происхождением, тоесть зависит от того, передается данный ген с геномом спермия или яйцеклетки (Pfeifer,2000).Именно метилирование ДНК является определяющим в установлении иподдержании межаллельных различий в импринтированных генах. Импринт возникает вгаметогенезе, стабильно наследуется в митозе, стирается в первичных половых клеткахпосле установления пола эмбриона, благодаря чему импринтинг может быть обратим впоследующих поколениях (Паткин, 2008).Геномный импринтинг является исключительно важным компонентом механизмарегуляции эмбрионального развития млекопитающих и, в частности, человека.

Так,кластер из десяти импринтированных генов, расположенных на хромосоме 11 в районер15.5, играет решающую роль в регуляции роста во время внутриутробного развитияэмбрионачеловека.Большинствогеновэтогокластерахарактеризуютсяпреимущественной экспрессией материнской аллели, за исключением гена IGF2,экспрессирующегося с отцовской аллели. Обратная ситуация характерна для кластерагенов, локализованных на хромосоме 15 в районе q11-13. Для генов этого участкахарактерна экспрессия отцовской аллели, кроме гена UBE3A, для которого свойственнаэкспрессия материнской аллели (Preece, Moore, 2000).Измененияэпигенотипа,приводящиекослаблениюилинарушениюустановившейся схемы импринтинга, способствуют развитию патологических состоянийклетки, в частности, ее злокачественному перерождению.