Диссертация (Хромосомная, клеточная и тканевая специфичность гидроксиметилирования ДНК в проэмбриональный и эмбриональный периоды развития человека)

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕУЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ«САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТКАФЕДРА ГЕНЕТИКИ И БИОТЕХНОЛОГИИФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ«НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ АКУШЕРСТВА, ГИНЕКОЛОГИИ ИРЕПРОДУКТОЛОГИИ ИМ. Д.О.ОТТА»На правах рукописиТихонов Андрей ВладимировичХРОМОСОМНАЯ, КЛЕТОЧНАЯ И ТКАНЕВАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬГИДРОКСИМЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК В ПРОЭМБРИОНАЛЬНЫЙ ИЭМБРИОНАЛЬНЫЙ ПЕРИОДЫ РАЗВИТИЯ ЧЕЛОВЕКАСпециальность 03.02.07 – генетикаДиссертацияна соискание ученой степеникандидата биологических наукНаучный руководитель:член-корр.

РАН, з.д.н., д.м.н., профессор В.С. БарановСанкт-Петербург – 2018ОГЛАВЛЕНИЕСПИСОК СОКРАЩЕНИЙ........................................................................................................ 5ВВЕДЕНИЕ ................................................................................................................................... 6ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ......................................................................................... 121.1. Метилирование ДНК ..................................................................................................... 121.2.

Открытие 5-гидроксиметилцитозина ........................................................................ 161.3. Механизмы деметилирования ДHК............................................................................ 171.4.Динамикаизменений5-гидроксиметилцитозинаприэпигенетическомрепрограммировании генома млекопитающих............................................................... 221.5. Роль 5-гидроксиметилцитозина в регуляции экспрессии генов ...........................

261.6. Влияние внешних факторов на изменения характера метилирования игидроксиметилирования ДНК соматических и половых клеток ................................ 271.7. Сперматогенез человека ............................................................................................... 301.8. Оогенез человека ............................................................................................................

351.9. Доимплантационное развитие зародыша человека ................................................ 381.10. Постимплантационное развитие зародыша человека. Развитие хориона иорганов дыхательной системы ........................................................................................... 43ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ .....................................................................................

472.1. Материал исследования ................................................................................................ 472.2. Методы ............................................................................................................................. 492.2.1. Приготовление препаратов метафазных хромосом и интерфазных ядер изнеоплодотворившихся яйцеклеток, зигот и бластомеров доимплантационныхзародышей человека ......................................................................................................... 492.2.2.Приготовлениецитогенетическихпрепаратовизфрагментовтестикулярной ткани, ворсин хориона и фрагментов эмбриональных органов ..

492.2.3.Приготовлениегистологическихпрепаратовизбиоптататканейсеменника ............................................................................................................................ 502.2.4. Приготовление препаратов из образцов эякулята ...........................................

512.2.5. QFH-окрашивание цитогенетических препаратов яйцеклеток, зигот,бластомеровдоиплантационныхзародышейисперматогенныхклетокчеловека ............................................................................................................................... 512.2.6.Иммунофлуоресцентноеокрашиваниецитогенетическихигистологических препаратов с помощью антител к 5hmC и 5mC .......................... 522.2.7. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) .................................................... 5422.2.8. Анализ препаратов ..................................................................................................

552.2.9.Измерениеинтенсивностифлуоресцентногосигналапослеиммунофлуоресцентной детекции 5hmC и 5mC на препаратах............................... 552.2.10. Статистическая обработка результатов ........................................................... 56ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ........................................................................................................

583.1.Распределение5hmCи5mCвгеномезародышейчеловеканадоимплантационных стадиях развития ............................................................................ 583.1.1. Гидроксиметилирование и метилирование ДНК метафазных хромосомразнородительского происхождения на стадии зиготы ............................................. 583.1.2. Распределение 5hmC и 5mC в ДНК метафазных хромосом дробящихсязародышей человека и на стадии бластоцисты ........................................................... 633.2.

Гидроксиметилирование и метилирование ДНК половых клеток человека .... 673.2.1. Распределение 5hmC и 5mC в ДНК мейотических хромосом яйцеклетокчеловека ............................................................................................................................... 673.2.2. Распределение 5hmC и 5mC в ДНК сперматозоидов человека ......................

693.2.3. Сопоставление содержания в экуляте сперматозоидов с 5hmC спараметрами спермограммы и с долей сперматозоидов с фрагментацией ДHК . 723.2.4. Становление рисунка гидроксиметилирования и метилирования ДНК всперматогенных клетках человека ................................................................................ 743.3. Анализ гидроксиметилирования и метилирования ДНК метафазных хромосому эмбрионов человека 5-12 недель развития ....................................................................

80ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ...................................................................................................... 894.1. Метилирование и гидроксиметилирование ДНК метафазных хромосомразнородительского происхождения на стадии зиготы ................................................. 894.2. Стадиоспецифические изменения метилирования и гидроксиметилированияДНК в проэмбриональный период развития человека .................................................

914.3. Распределение 5hmC и 5mC в ДНК метафазных хромосом дробящихсязародышей человека и на стадии бластоцисты ............................................................... 954.4. Распределение 5hmC и 5mC на метафазных хромосомах у эмбрионов человекана сроке 5-12 недель развития ............................................................................................

99ЗАКЛЮЧЕНИЕ ....................................................................................................................... 102ВЫВОДЫ .................................................................................................................................. 104СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ..................................................................................................... 1063ПРИЛОЖЕНИЕ .......................................................................................................................

1284СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ5caC – 5-карбоксилцитозин5fC – 5-формилцитозин5mC – 5-метилцитозин5hmC – 5-гидроксиметилцитозин5hmU – 5-гидроксиметилeурацилАТ-5mС – антитела к 5-метилцитозинуАТ-5hmC – антитела 5-гидроксиметилцитозинуAcD – актиномицин DAID – цитидиновая дезаминаза, индуцируемая активацией (activation-induced cytidinedeaminase)APOBEC–каталитическийполипептидфермента,редактирующегом-РНКаполипопротеина B (apolipoprotein B mRNA-editing enzyme, catalytic polypeptide)BER – эксцизионная репарация оснований (base excision repair)CpG – цитозин-гуаниновый динуклеотид (C – цитозин, G – гуанин, p – фосфодиэфирнаясвязь между этими нуклеотидами)DAPI – 4,6-диамино-2-фенилиндолDNMT – ДНК метилтрансфераза (DNA methyltransferase)FISH – флуоресцентная гибридизация in situMBD – метилцитозинсвязывающий домен (methylcytosine-CpG-binding domain)МеСР – метилцитозинсвязывающий белок (methylcytosine binding protein)QFH – Q-сегментация хромосом, выявляемая с помощью флуорохрома Хехст 33258(quinacrine fluorescence Hoechst)SMUG – селективная монофункциональная гликозилаза, действующая на урацилоднонитевой ДНК (single-strand selective monofunctional uracil DNA glycosylase)TDG – тиминовая ДНК-гликозилазаАФК – активные формы кислородаВКМ – внутренняя клеточная массаППК – первичные половые клеткипре-ППК – предшественники первичных половых клетокТЭ – трофэктодермаФГА – фитогемагглютининЭКО – экстракорпоральное оплодотворение5ВВЕДЕНИЕАктуальность темы исследованияОнтогенез млекопитающих начинается с оплодотворения – слияния двухвысокоспециализированных клеток – ооцита и сперматозоида, в результате которогоформируется тотипотентная зигота.

В основе способности зиготы дать начало новомуорганизму с более чем 200-ми типами клеток лежит сложная и скоординированная работамеханизмов, регулирующих функции генома и устанавливающих специфические дляклеточных линий профили экспрессии генов. Ключевую роль в определении судьбыклеток играют эпигенетические модификации ДНК и белков хроматина (Nashun et al.,2015). Присоединение и удаление различных химических групп в определенных сайтахможеткакспособствовать,такипрепятствоватьсвязываниюсхроматиномтранскрипционных факторов, детерминируя таким образом его функционально активныеи инертные участки. За счёт специфического для каждой клеточной линии набораэпигенетическихмодификаций(эпигенетическогопаттерна)устанавливаютсяинаследуются в ряду клеточных делений определенные профили экспрессии генов.

Инымисловами, именно эпигенетические механизмы определяют где, как и когда должна бытьреализована генетическая информация (Dean, 2016).В отличие от генетической информации, одинаковой во всех клетках организма и внорме не претерпевающей изменений в онтогенезе, эпигеном является пластичной ивысокодинамичнойсистемой,подверженнойкакзапрограммированным,такиспонтанным изменениям. Так, в онтогенезе млекопитающих дважды – в гаметогенезе ираннем эмбриогенезе – происходит репрограммирование эпигенома: глобальныеизменения, во время которых стираются предсуществующие эпигенетические паттерны иустанавливаютсяновые(Reik,2007;Lange,Schneider,2010).Эти«волны»эпигенетического репрограммирования являются неотъемлемой частью программыразвития и обеспечивают непрерывность передачи генетической информации, делаявозможным переходы от высокоспециализированных гамет к тотипотентной зиготе, азатем от соматических клеток к половым.

В то же время, известно, что воздействие какэкзо-, так и эндогенных факторов способно приводить к спонтанному изменениюэпигенетических паттернов, и как следствие, нарушению профилей экспрессии генов(Jefferson et al., 2013). Очевидно, что в периоды эпигенетического репрограммированиягенома эффект от таких воздействий будет наиболее выраженным.К эпигенетическим изменениям хроматина относят модифицирование цитозинаДНК и посттрансляционные модификации гистоновых белков (Holmquist, Ashley, 2006).6Модификация гистоновых белков происходит за счет присоединения метильной,ацетильной или фосфатной групп к аминокислотным остаткам в N-терминальныхучастках гистонов (Luger et al., 1997; Li et al., 2018). Участие в процессе трёх химическихгрупп, а также возможность их присоединения к различным аминокислотным остаткам впределах одного белка-гистона формирует широкий спектр возможных модификаций,определяющих, так называемый, «гистоновый код» нуклеосомы.