Диссертация (Хромосомная, клеточная и тканевая специфичность гидроксиметилирования ДНК в проэмбриональный и эмбриональный периоды развития человека), страница 4

Доказано, что помимометилирования ДНК определенных генов, в обеспечении ГИ важную роль играют15модификации белков хроматина, в частности, процесс ацетилирования гистонов (Pedone etal., 1999).Метилирование ДНК может резко изменяться при канцерогенезе: изменениестатуса метилирования ДНК может приводить к инактивации генов-супрессоровзлокачественного роста и активации онкогенов (Gal-Yam et al., 2008).В течение многих лет метилирование ДНК считалось единственной стабильнойэпигенетической модификацией цитозина, влияющей на структуру и функции генома внорме (Razin, Riggs, 1980; Patkin, 2002; Hashimshony et al., 2003) и при различныхпатологических состояниях (Skryabin et al., 2013; Freeman et al., 2016; Zhang et al., 2016;Skryabin et al., 2017).

Однако, было обнаружено, что окисление 5-метилцитозина спомощьюТЕТ-ферментовприводитквозникновениютрёхдругихформмодифицированного цитозина – 5-гидроксиметилцитозина (5hmC), 5-формилцитозина(5fC) и 5-карбоксицитозина (5caC) (Tahiliani et al., 2009; Ito et al., 2011). В настоящеевремя активно обсуждается биологическая роль этих производных 5mC, в особенности5hmC, – в качестве промежуточных продуктов активного деметилирования ДНК, а такжеих функциональная и структурная роль в геноме (Branco et al., 2011; Pfeifer et al., 2013;Kantidze, Razin, 2017).1.2.

Открытие 5-гидроксиметилцитозинаБолее 60 лет назад 5-гидроксиметилцитозин был выявлен в составе ДНКбактериофага Т-4 (Wyatt, Cohen, 1952). Оказалось, что замена цитозина на 5гидроксиметилцитозин, который может подвергаться гликозилированию, способствуетзащите ДНК бактериофага от разрушения рестриктазами бактерий (Kornberg et al., 1959;Hattman,Fukasawa,1963;Shedlovsky,1963).Brenner,Образование5-гидроксиметилцитозина у бактериофагов происходит за счёт модифицирования ДНК insitu,апутёмвстраиваниявгеномвирусавпроцессесинтезаДНКгидроксиметилдезоксицитидинтрифосфата вместо дезоксицитидинтрифосфата (Kornberget al., 1959).У млекопитающих 5-гидроксиметилцитозин был описан в 1972 году при изученииДHК, выделенной из мозга мышей и крыс (Penn et al., 1972).

Было установлено, что 5гидроксиметилцитозин составляет около 15% от общего числа остатков цитозина. Однако,это открытие не привлекло внимания, так как попытки воспроизвести результаты этогоисследования были безуспешны (Kothari, Shankar, 1976). На протяжении многих летисследователи считали 5-гидроксиметилцитозин случайным продуктом оксидативногоповреждения ДНК (Kothari, Shankar, 1976; Steinberg et al., 1992; Valinluck, Sowers, 2007).16Вернулись к изучению 5-гидроксиметилцитозина только в 2009 году, когда былоподтверждено его наличие в геноме млекопитающих.Методами тонкослойнойхроматографии, жидкостной хроматографии высокого давления и масс-спектрометриибыло показано, что 5-гидроксиметилцитозин присутствует в клетках мозга мыши и неявляется случайным продуктом при повреждении ДНК (Kriaucionis, Heintz, 2009). В этоже время ещё одна группа исследователей (Tahiliani et al., 2009) продемонстрироваланаличие 5-гидроксиметилцитозина в эмбриональных стволовых клетках мыши, а такжеустановила биохимические пути, связывающие 5-гидроксиметилцитозин с уже известнойи хорошо изученной эпигенетической модификацией ДНК – 5-метилцитозином.

Этиоткрытия дали начало целой серии исследований роли 5-гидроксиметилцитозина в геномемлекопитающих.1.3. Механизмы деметилирования ДHКПроцесс метилирования ДНК обратим. Удаление метильных групп из ДНК –деметилирование – может осуществляться двумя способами: пассивно и активно.Пассивное деметилирование реализуется после репликации ДНК. За счет отсутствияметилазной активности новосинтезированная нить ДНК не метилируется по образцустарой, и образуется полуметилированная или, так называемая, гемиметилированнаяДНК. Последующая репликация при отсутствии метилазной активности приводит кобразованию уже полностью деметилированной ДНК.

При активном деметилированиизадействованы ферментативные системы, катализирующие превращение 5-метилцитозинав цитозин независимо от репликации (Bhutani et al., 2011; Dean, 2016). Предполагаютсуществование нескольких механизмов независимого от репликации деметилированияДНК.Удаление5-метилцитозинаизДНКможетосуществлятьсяспомощьюспецифических гликозилаз. ДНК-гликозилазы – это группа ферментов, которыераспознают и удаляют поврежденные или некомплементарные основания с образованиемапуриновых/апиримидиновых сайтов. Гликозилаза ROS1 Arabidopsis thaliana обладаетактивностью в апуриновых/апиримидиновых сайтах и после удаления 5-метилцитозина споследующим расщеплением нити ДНК осуществляет быструю репарацию этого разрыва(Zhu, 2009). У млекопитающих подобным образом осуществляется эксцизионнаярепарация оснований (BER – base excision repair).

Гликозилазы млекопитающих TDG(thymine DNA glygosylase – тиминовая ДНК-гликозилаза) и MBD4 (methyl binding domainIV)имеютгомологиюсгликозилазамирастений.TDGудаляеттиминизнекомплементарных пар цитозин-тимин, гуанин-тимин и тимин-тимин, тем самым17защищая геном от мутаций, к которым приводит спонтанное дезаминирование 5mC втимин. Тиминовая гликозилаза также специфично вырезает 5-фopмилцитозин и 5карбоксилцитозин,хотяинеимееттакойактивностипоотношениюк5-гидроксиметилцитозину (Maiti, Drohat, 2011). MBD4, вероятно, имеет важную роль влокус-специфичномдеметилировании.Показано,чтогормон-индуцированноефосфорилирование MBD4 существенно повышает его гликозилазную активность вотношении 5-метилцитозина и вызывает активное деметилирование промотора генаCYP27B1 (Kim et al., 2009).Другимвозможныммеханизмомактивногодеметилированиясучастиемэксцизионной репарации оснований является дезаминирование 5-метилцитозина собразованием тимина и его последующей заменой на цитозин (Dean, 2016).Дезаминирование 5-метилцитозина могут осуществлять ферменты AID и APOBEC1(Conticello et al., 2005).

Их гены экспрессируются в ооцитах и примордиальных половыхклетках мышей, что свидетельствует об их возможном участии в процессе глобальногодеметилирования. На гетерокарионах, полученных при слиянии фибробластов человека иэмбриональных стволовых клеток мыши, показано, что AID необходим для активногодеметилирования промоторов генов OCT4 и NANOG в процессе репрограммированиягенома фибробластов (Bhutani et al., 2010).

У мышей, нокаутированных по Aid, уровеньсодержания 5-метилцитозина в геноме первичных половых клеток выше, чем у мышейдикого типа (Popp et al., 2010). Однако, у таких мышей отсутствуют видимые нарушенияразвития и сохраняется фертильность, что свидетельствует о существовании другихмеханизмов активного деметилирования ДНК. После дезаминирования ферментыэксцизионной репарации распознают неправильные пары тимина с гуанином и вырезаюттимин с последующей вставкой немодифицированного цитозина (Fritz, Papavasiliou, 2010)(рис.

2). Однако дезаминазы действуют преимущественно на однонитевую ДНК, в товремя как большинство метилированных локусов располагается в двунитевой ДНК вокружении CpG-динуклеотидов. Так же известно, что активность дезаминаз к 5метилцитозину снижена по сравнению с немодифицированным цитозином (Bransteitter etal., 2003). К тому же, спонтанное гидролитическое дезаминирование цитозина происходитобычно со скоростью 8 оснований на клетку в час, что соответствует 100 основаниям наклетку в сутки (Alberts et al., 2002). Однако активное деметилирование мужскогопронуклеуса в зиготе проходит гораздо быстрее (Saitou et al., 2012; Seisenberger et al.,2012). Поэтому, вероятно, дезаминазный путь не является основным в активномдеметилировании.18Ещё одной группой ферментов, способных осуществлять превращение 5метилцитозина, являются белки семейств TET (Ten-Eleven-Translocation).

В геномемлекопитающих белки ТЕТ гидроксилируют 5-метилцитозин с образованием 5гидроксиметилцитозина (Tahiliani et al., 2009). Белки ТЕТ являются 2-оксоглутарат- иFe(II)-зависимыми диоксигеназами, гомологичными белкам трипаносомы JBP1 и JBP2 –оксидазам метильной группы тимина (Yu et al., 2007; Cliffe et al., 2009).

На основе этойгомологии была предположена, а впоследствии и доказана способность белков ТЕТокислять метильную группу 5-метилцитозина (Tahiliani et al., 2009).В семейство TET входят три белка: TET1, TET2 и TET3, которые обладаютокислительной активностью и участвуют в превращении 5-метилцитозина в 5гидроксиметилцитозин in vivo и in vitro (Ito et al., 2010). Субстратом для ТЕТ1 можетслужить и полностью метилированная, и полуметилированная (или гемиметилированная)ДНК, причем метилированный цитозин распознается не только в составе CpGдинуклеотидов, но и в других последовательностях ДНК (Tahiliani et al., 2009; Ficz et al.,2011; Pastor et al., 2011). Белки семейства ТЕТ имеют тканевую специфичность, чтоуказывает на их разные функции в онтогенезе млекопитающих. Так, ТЕТ1 впервые былобнаружен в клетках Пуркинье головного мозга мыши.

Большое количество белков ТЕТ1и ТЕТ2 обнаружено в эмбриональных стволовых клетках мыши (Kriaucionis, Heintz, 2009;Tahiliani et al., 2009). TET2 является специфичным для клеток гемопоэтического ряда инервных клеток в постнатальный период, а делеции участка хромосомы, содержащегоТЕТ2, были выявлены при миелопролиферативных заболеваниях млекопитающих. Этопозволяет предположить наличие у ТЕТ2 функции супрессора опухолей (Tahiliani et al.,2009). TET3, в свою очередь, накапливается в ооцитах и оплодотворившихся яйцеклеткахмлекопитающих.

Его транскрипты после оплодотворения очень быстро деградируют ипрактически полностью исчезают уже на стадии двухклеточного зародыша (Iqbal et al,2011). Белки семейства ТЕТ содержат несколько консервативных доменов, в том числедомен CXXC, обладающий сильным сродством к кластерам неметилированных CpGдинуклеотидов, и каталитический домен, типичный для 2-оксоглутарат- и Fe(II)зависимых диоксигеназ. Мутационные изменения структуры Fe(II)-связывающего доменабелков ТЕТ приводят к потере ферментативной активности (Tahiliani et al., 2009; Ito et al.,2010).Супрессиюгидроксиглутарат,каталитическойкоторыйявляетсяфункциибелковконкурентнымТЕТтакжеингибиторомвызывает2-2-оксоглутарат-зависимых диоксигеназ (Xu et al., 2011).Белки семейства ТЕТ способны окислять не только 5-метилцитозин до 5гидроксиметилцитозина, но и образовывать продукты окисления II и III степени:19карбонильную форму 5-метилцитозина (5-формилцитозин) и карбоксильную форму 5метилцитозина (5-карбоксилцитозин), что было доказано в 2011 году в двух независимыхсериях экспериментов (He et al., 2011; Ito et al., 2011).

5-формилцитозин и 5карбоксилцитозин были обнаружены в геноме эмбриональных стволовых клеток мыши,хотя их содержание оказалось значительно ниже, чем 5-гидроксиметилцитозина (He et al.,2011; Ito et al., 2011; Pfaffeneder et al., 2011). В культурах клеток, лишённых активностиТЕТ1, содержание 5-формилцитозина и 5-карбоксилцитозина в ДНК оказалосьсущественно сниженным (Ito et al., 2011).5-формилцитозин и 5-карбоксилцитозин в CpG сайтах специфически распознаютсяи удаляются из ДНК гликозилазой TDG, являющейся ключевым ферментом эксцизионнойрепарации (He et al., 2011; Maiti, Drohat, 2011).