Диссертация (Хромосомная, клеточная и тканевая специфичность гидроксиметилирования ДНК в проэмбриональный и эмбриональный периоды развития человека), страница 2

Эпигенетическиемодификации ДНК, напротив, немногочисленны. На протяжении нескольких десятилетийединственной модификацией ДНК с эпигенетическим эффектом считалось метилированиецитозина.МетилированиеосуществляютферментыДНК-метилтрансферазы,катализирующие присоединение метильной группы в пятом положении цитозина, врезультатечегообразуется5-метилцитозин(Ванюшин,2006;Senner,2011).Метилирование ДНК, являясь ключевой эпигенетической модификацией генома,участвует не только в регуляции генетической активности, но и контролируетразнообразныебиологическиеподдержание стабильностипроцессы,включаяклеточнуюдифференцировку,генома, репликацию, защиту геномаотмобильныхгенетических элементов, онкогенез и геномный импринтинг (Reik et al., 2001; Goll, Bestor,2005; Straussman et al, 2009).

В 2009-2011 годах было установлено, что 5-метилцитозинможет подвергаться окислению белками ТЕТ (Ten-Eleven-Translocation), в результатекоторого последовательно образуются три кислородсодержащих производных – 5гидроксиметилцитозин, 5-формилцитозин и 5-карбоксилцитозин. 5-формилцитозин и 5карбоксилцитозин являются мишенями для системы эксцизионной репарации, котораявырезает их из ДНК, заменяя на немодифицированный цитозин (Tahiliani et al., 2009; Ito etal., 2011). Таким образом, ТЕТ-опосредованное окисление 5-метилцитозина являетсямеханизмом активного (ферментативного) деметилирования ДНК – одного из ключевыхэтаповэпигенетическогорепрограммированиягеномагаметиэмбрионовмлекопитающих.В результате изучения продуктов окисления 5-метилцитозина было установлено,что они выполняют не только роль промежуточных звеньев в цепи реакций активногодеметилирования ДНК, но и участвуют в регуляции работы генома.

Прежде всего, этоотносится к 5-гидроксиметилцитозину – самому стабильному из всех трёх продуктовокисления 5-метилцитозина. Так, 5-гидроксиметилцитозин специфично распознаетсянекоторыми белками, регулирующими метаболизм клетки, в частности: RPL26, PRP8,MHS6, MeCP2, UHRF, Thy28 (Iurlaro et al., 2013; Spruijt et al., 2013; Zhou et al., 2014). Для5-гидроксиметилцитозина характерна специфичная локализация в энхансерах, участках,фланкирующих промоторы или CpG-островки, и собственно в самих генах. При этом7наличие 5-гидроксиметилцитозина в энхансерах положительно коррелирует с ихактивностью (Stroud et al., 2011; Hon et al., 2014; Lu et al., 2014).

В CpG-островках 5гидроксиметилцитозин стабилизирует их неметилированное состояние, а внутри гена, какполагают, может предотвращать инициацию антисмысловой транскрипции (Williams et al,2012; Song, Pfeifer, 2016). Таким образом, 5-гидроксиметилцитозин является как маркеромпроцесса активного деметилирования, так и стабильной модификацией цитозина сосвоими собственными функциями.Степень разработанности темыНесмотря на то, что 5-гидроксиметилцитозин уже несколько лет является объектомпристального изучения, многие аспекты, касающиеся его роли в эпигенетическомрепрограммировании генома, в клеточной дифференцировке и в реакции в ответ навоздействие средовых факторов, остаются до конца не выясненными.

Определённаяинформация на эту тему была получена на модельных объектах (Hajkova et al., 2010; Parket al., 2010; Wossidlo et al., 2010; Iqbal et al., 2011; Inoue, Zhang, 2011; Zhang et al., 2012;Heras et al., 2014). Работы по изучению особенностей гидроксиметилирования ДНК вгаметогенезе и эмбриогенезе человека остаются малочисленными в связи с трудностямиполучения биологических образцов для исследования. Между тем очевидно, что какфундаментальную, так и практическую значимость представляет вопрос о том, когдаустанавливается, как поддерживается и каким образом изменяется в геноме человекараспределение 5-гидроксиметилцитозина.

При этом, наибольшего внимания заслуживаютименно периоды гаметогенеза и эмбриогенеза, когда происходит репрограммированиегеномаистановлениеэпигенетическихпрофилей,регулирующихдальнейшуюреализацию программы развития.В связи с этим цель настоящего исследования – изучить поэтапные измененияхарактерагидроксиметилированияДНКвгаметогенезе,доимплантационномипостимплантационном эмбриогенезе человека.Задачи:1) колокализовать5-метилцитозин и5-гидроксиметилцитозин на метафазныххромосомах разнородительского происхождения на стадии зиготы;2) определить характер гидроксиметилирования ДНК метафазных хромосом в ходеделений дробления до стадии бластоцисты;83) провести сравнительный анализ гидроксиметилирования ДНК в яйцеклетках,сперматозоидах и зиготах;4) проанализировать характер гидроксиметилирования ДНК в сперматогенныхклетках;5) оценить взаимозависимость между характером гидроксиметилирования ДНКсперматозоидов в эякуляте, параметрами спермограммы и долей сперматозоидов сфрагментированной ДНК;6) охарактеризоватьтканеспецифическиеособенностигидроксиметилированияметафазных хромосом в постимплантационном эмбриогенезе человека на 5-12неделе развития.Научная новизна:В настоящей работе впервые проведён анализ гидроксиметилирования ДНКметафазных хромосом из половых клеток, зигот, бластомеров дробящихся зародышей иклеток эмбриональных и экстраэмбриональных тканей постимплантационных эмбрионовчеловека.

Установлено, что на стадии зиготы метафазные хромосомы отцовскогопроисхожденияподвергаютсяактивномудеметилированиюсобразованием5-гидроксиметилцитозина в большей степени, чем метафазные хромосомы материнскогопроисхождения. Гидроксиметилированная ДНК распеделена неравномерно в метафазныххромосомах зигот человека: 5-гидроксиметилцитозин преимущественно локализован в R-,но не G- и C-сегментах. При делениях дробления вплоть до стадии бластоцистыпроисходитпассивнаяпотерягемигидроксиметилированныхраспределения5-гидроксиметилцитозинахромосом5-гидроксиметилцитозинаивсохранениемсобразованиемсегментоспецифичногогидроксиметилированныххроматидах.Получены уникальные данные о межхромосомных, межклеточных и межтканевыхразличиях гидроксиметилирования ДНК метафазных хромосом эмбрионов человека 5-12недель развития, обусловленные случайным сочетанием гидроксиметилированных,гемигидроксиметилированных и негидроксиметилированных сестринских хроматид игомологичных хромосом.

Впервые установлена связь между параметрами спермограммыи характером гидроксиметилирования сперматозоидов в эякуляте: увеличение долигидроксиметилированныхсперматозоидовассоциированососнижениемкачестваэякулята и нарушениями фертильности.9Теоретическая и практическая значимостьРезультаты настоящей работы вносят существенный вклад в пониманиемеханизмов эпигенетической регуляции и организации работы генома в онтогенезечеловека. Описанные изменения гидроксиметилирования ДНК в половых клетках, вдоимплантационных и постмиплантационных эмбрионах позволяют приблизиться кпониманиюбиологическойроли5-гидроксиметилцитозинавпроцессахрепрограммирования генома человека в онтогенезе.Полученныерезультатымогутслужитьосновойприразработкеисовершенствовании методов оценки функционального состояния генома.

Оценкахарактера гидроксиметилирования мужских гамет может стать новым информативнымкритерием качества эякулята, что будет иметь существенное значение для повышенияэффективности вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).Методология и методы исследованияВ настоящем исследовании использован комплексный подход с применениемцитогенетических,молекулярно-цитогенетических,гистологическихииммунофлуоресцентных методов, флуоресцентной микроскопии и ряда статистическихметодов.

Более подробно генетические и статистические методы исследования отраженыв разделе «Материалы и методы».Положения, выносимые на защиту:1. Характер гидроксиметилирования метафазных хромосом зигот является специфичнымдля этой стадии онтогенеза, не наследуется из гамет, а устанавливается de novo иопределяется как родительским происхождением, так и типом сегмента хромосом.2. Деметилирование генома доимплантационных эмбрионов человека происходит за счёткак активного деметилирования с образованием 5-гидроксиметилцитозина на стадиизиготы,такипассивнойпотери5-гидроксиметилцитозинасобразованиемгемигидроксиметилированных хромосом и пассивной потери 5-метилцитозина собразованием гемиметилированных хромосом при делениях дробления до стадиибластоцисты.3. Гидроксиметилирование метафазных хромосом в постимплантационном развитиичеловека характеризуется выраженной гетерогенностью между гомологичнымихромосомами, между хромосомами в пределах метафазной пластинки, междуметафазными пластинками в пределах одной ткани и между тканями эмбриона,10обусловленнойразличнымикомбинациямигидроксиметилированных,гемигидроксиметилированных и негидроксиметилированных хромосом.4.

Запрограммированное гидроксиметилирование ДНК в сперматогенных клеткахчеловека происходит волнообразно на двух стадиях их дифференцировки: всперматогониях типа Ad и сперматидах.5. Гидроксиметилирование ДНК характерно для небольшой доли эякулированныхсперматозоидов.Долягидроксиметилированныхсперматозоидоввэякулятевзаимосвязана со статусом фертильности и параметрами спермограммы, что позволяетрассматривать её как новый критерий качества эякулята.Степень достоверности и апробация результатовДля интерпретации результатов привлечено достаточное количество данныхлитературы. Сформулированные в работе выводы логично вытекают из анализа иобобщения результатов исследования и поэтому не вызывают возражений.Полученные в ходе работы результаты опубликованы в виде 8 научных статей врецензируемых отечественных и зарубежных журналах и 11 тезисных сообщений.Материалы работы были представлены на российских и международных конференциях:European Human Genetics Conference 2016 (21 – 24 мая 2016 г., Барселона, Испания),European Cytogenetic Conference 2015 (4 – 7 июля 2015 г., Страсбург, Франция), EuropeanHuman Genetics Conference 2014 (31 мая – 3 июня 2014, Милан, Италия), XVIIВсероссийский симпозиум «Структура и функции клеточного ядра» (28 – 30 октября 2014,Санкт-Петербург,РоссийскаяФедерация),нанаучныхсеминарахлабораториипренатальной диагностики наследственных и врожденных болезней человека ФГБНУ«НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии им.