Диссертация (Хромосомная, клеточная и тканевая специфичность гидроксиметилирования ДНК в проэмбриональный и эмбриональный периоды развития человека), страница 9

Между ооцитами ифолликулярными клетками образуется множество микроворсинок и щелевых контактов,через которые происходит обмен аминокислотами и глюкозой, необходимыми для ростаооцита. В этот период происходит накопление белков, рибосомных, транспортных идругих типов РНК. Это необходимо будущей зрелой яйцеклетке и зиготе, котораяпредстоит быстро совершить ряд делений дробления, для чего потребуется большоеколичество запасенной энергии. Также за счёт аппарата Гольджи накапливаютсякортикальные гранулы, которые во время оплодотворения защитят яйцеклетку отполиспермии.Первый блок оогенеза длится до полового созревания. За это время первичныефолликулы увеличиваются в размере, за счёт роста самих ооцитов и увеличения числафолликулярных клеток, после чего становятся вторичными фолликулами.

Между ооцитоми фолликулярными клетками происходит формирование неклеточной мембраны, которуюназывают блестящей оболочкой (zona pellucida). Блестящая оболочка содержит рецепторык сперматозоидам и другие компоненты, играющие важную роль в оплодотворении(Carlson, 2009).В ооцитах I порядка и растущих ооцитах в CpG-островках наблюдают уменьшениесодержания H3K4me2 и H3K4me3 – модификаций, являющихся маркерами активнойтранскрипции, тогда как содержание H3K36me3 увеличивается в растущих ооцитах.36Таким образом, удаление метилирования H3K4 требуется для правильного установленияметилирования в CpG-островках (Stewart et al., 2015).

Кроме того, замена гистонов играеткритическую роль в регуляции транскрипции и нормальном развитии ооцитов.Альтернативный вариант гистона H3.3, который заменяет H3, является важным факторомрепрограммирования генома ооцита (Lin et al., 2014, Nashun et al., 2015). У мышей,нокаутных по шаперону HIRA, который участвует во включении гистона H3.3, в ооцитах Iпорядка не происходило корректной замены гистонов. Это приводило к аномальнойструктуре хромосом, что в свою очередь, вело к нарушению метилирования ДНК de novo.В результате у ооцитов наблюдали серьёзные дефекты развития и, как следствие, апоптоз(Nashun et al., 2015).Впериодполовогосозреваниявфолликулеподдействиемфолликул-стимулирующего гормона (ФСГ) происходит образование полости (антрума), котораязаполняется фолликулярной жидкостью.

После этого фолликулярные клетки разделяютсяна 2 группы: прилегающие непосредственно к ооциту клетки кумулюса и находящиесямежду полостью и фолликулярной мембраной пристеночные фолликулярные клетки. Вответ на гормональное воздействие фолликул резко увеличивается в размере и давит наповерхность яичника. Такой фолликул называется третичным или граафовым пузырьком.Мейоз возобновляется за 10-12 часов до овуляции. Во время каждого менструальногоцикла от 10 до 30 первичных ооцитов завершают первое деление мейоза и продолжаютразвитие, при этом остальные ожидают своей очереди ещё долгие годы. После первогоделения мейоза образуется 2 неравные клетки – ооцит II порядка и первое полярноетельце (Swain, Pool, 2008). Тогда же третичный фолликул начинает выпячиватьповерхность яичника и ещё больше увеличивается в размере, главным образом, за счётпротеогликанов и гиалуроновой кислоты.

Такой фолликул готов к овуляции и ожидаетстимула в виде ФСГ и лютеинизирующего гормона (ЛГ), выделяемых передней долейгипофиза (Carlson, 2009).Ооцит II порядка, вступивший во второе деление мейоза, претерпевает блокоогенеза на стадии метафазы, который снимается только после оплодотворениясперматозоидом.

Если оплодотворение не произошло, то такой ооцит не может завершитьмейоз и подвергается апоптозу. Если оплодотворение прошло успешно, ооцит завершаетвторое деление мейоза, в результате которого образуется второе полярное тельце, а зиготаприступает к формированию отцовского и материнского пронуклеусов и готовится к ихслиянию (Carlson, 2009). Установлено, что метилирование ДНК ооцита II порядка ипервого и второго полярного тельца не отличаются (Guo et al., 2014).371.9.

Доимплантационное развитие зародыша человекаОнтогенез начинается с момента оплодотворения яйцеклетки сперматозоидом иобразования зиготы. В результате оплодотворения возникает одноклеточный зародыш –тотипотентная зигота.Сперматозоиды приобретают способность к оплодотворению только спустянескольких часов пребывания в половых путях женщины. Во время их продвижения пояйцеводам, происходит удаление защитных белков, мукополисахаридов и холестерина снаружнойплазматическойэлектрическийзарядмембраны. Внаружнойрезультате этих процессов изменяетсямембраны,усиливаетсяпотреблениекислорода,возрастает подвижность сперматозоидов. Места оплодотворения в яйцеводе достигаюттолько несколько сперматозоидов из общего числа 30-40 млн клеток в одном эякуляте.Основные биологические барьеры на пути проникновения сперматозоида вовулировавшую яйцеклетку представлены клетками лучистого венца (corona radiata),блестящей (zona pellucida) и плазматической (вителлиновой) оболочками яйцеклетки.Лучистый венец представляет собой слой фолликулярных клеток, окружающихяйцеклетку.

Преодоление лучистого венца достигается активным движением самогосперматозоида,атакжезасчетрастворенияиразжижениямежклеточногомукополисахаридного матрикса гиалуронидазой, выделяемой акросомами погибшихспермиев. При диссоциации лучистого венца обнажается небольшой участок болееглубоко расположенной блестящей оболочки.Пройдя через лучистый венец, сперматозоид связывается с поверхностьюблестящей оболочки. Происходит так называемая «акросомная реакция»: в результатеразрушения наружной акросомной мембраны сперматозоида высвобождаются литическиеферменты (гиалуронидаза, акрозин, нейраминидаза), которые обеспечивают пенетрациюблестящей оболочки. Общая продолжительность акросомной реакции составляет 10–15минут.Пройдячерезпостакросомальнойблестящуюобластьюоболочку,(экваториальнымсперматозоидсегментом)связываетсяссвоеймикрофиламентамивителлиновой оболочки и погружается внутрь ооплазмы путем пиноцитоза, то есть безразрушения целостности наружной мембраны яйцеклетки.

Плазмолемма сперматозоидапри этом «сползает» и закрывает отверстие, образовавшееся в плазмолемме ооцита. Хвостсперматозоида остается снаружи и отпадает.Присоединение сперматозоида к плазматической мембране сопровождаетсяответной реакцией яйцеклетки – «кортикальной реакцией». Её начало знаменуетсялокальным повышением концентрации ионов Са2+ – от места слияния мембран гамет к38периферии. Это стимулирует распад находящихся в кортикальном слое ооплазмылизосомоподобных структур – кортикальных гранул, содержимое которых (протеиназы,пероксидазы, нейраминидаза) быстро достигает сначала плазматической, а затем иблестящей оболочек.

При этом происходит сокращение кортикального слоя ооплазмы, врезультате между блестящей и плазматической оболочками появляется перивителлиновоепространство.рецепторныхВсамойблестящейгликопротеиновZP3,оболочкечтонаблюдаетсяделаетбыстроеневозможнымразрушениеприкреплениеипроникновение в яйцеклетку других сперматозоидов (Кнорре, 1967; Дыбан, Баранов,1978).

Кортикальная реакция приводит к снятию мейотического блока, быстромузавершению яйцеклеткой 2-го деления созревания и отделению в перивителлиновоепространство 2-го полярного тельца. Головка сперматозоида, попавшая в ооплазму врезультате оплодотворения, и оставшийся после 2-го мейотического деления гаплоидныйнабор хромосом яйцеклетки трансформируются соответственно в мужской и женскийпронуклеусы. Оплодотворение завершаеся.

Начинается индивидуальное развитие новогоорганизма.Доимплантационное развитие у человека занимает около 6-7 дней. Собственноразвитие зародыша начинается с формирования мужского и женского пронуклеусов, чтоисходит через 2-3 часа после оплодотворения. Мужской пронуклеус формируется раньшеженского. Деконденсация хромосом мужского пронуклеуса выражена в большей степени,чем женского.

В результате размеры мужского пронуклеуса несколько превосходятразмеры женского. Формирование обоих пронуклеусов завершается через 12 часов послеоплодотворения. Репликация хромосом в обоих пронуклеусах начинается через 9 часовпосле завершения их формирования. Хромосомы конденсируются и приблизительно через30 часов после оплодотворения, когда растворяются ядерные оболочки, происходитсингамия – хромосомный материал обоих пронуклеусов объединяется в одной метафазнойпластинке (Баранов, Кузнецова, 2007). Таким образом, происходит объединениегенетического материала отцовской и материнской половых клеток, в результате котороговозникает диплоидная зигота. Далее наступает первое деление дробления. Дроблениепредставляет собой серию митотических делений зиготы с образованием бластомеровменьшего размера. Митотические деления зиготы и в последующем бластомеровпроисходят с увеличением числа клеток, но без увеличения их массы. Для зародышачеловека характерно полное (голобластическое), неравномерное и асинхронное дробление– разные бластомеры дробятся с различной скоростью, поэтому зародыш на отдельныхстадиях дробления содержит нечетное число клеток.

Первое деление дробленияпродолжается в среднем около 30 часов, последующие – более короткие – 18-24 часа.39Начиная с двухклеточной стадии, бластомеры дробятся асинхронно, что приводит кформированию зародышей с нечётным количеством бластомеров. В процессе дроблениязародыш перемещается по маточной трубе. Заканчивается дробление в полости матки на6-е сутки (Баранов, Кузнецова, 2007).Бластомеры первой генерации, как и зигота, тотипотентны – каждый бластомерспособен развиться в полноценный организм (Баранов, Кузнецова, 2007; Biechele et al.,2015). Последующие деления дробления следуют с короткой интерфазой и образованиемвсё более мелких бластомеров (Dyban, Baranov, 1987). Увеличение массы бластомеров впроцессе дробления не происходит, поскольку интерфаза между делениями оченькороткая и отсутствует G1-фаза, в течение которой при обычном митозе дочерние клеткирастут и восстанавливают свои размеры до размеров материнской клетки (Lehtonen, 1980).Первые деления дробления осуществляются за счёт накопленной ооцитом ещё впериод оогенеза генетической информации.

Зародыш человека обладает достаточнымзапасом готовых белков, рибонуклеопротеиновых комплексов, необходимых для синтезановых белков, а также энергетических ресурсов и питательных веществ, чтобы полностьюобеспечить начальные этапы эмбриогенеза. Синтез белков, необходимых на этой стадии,происходит на матрицах РНК, синтезированных ещё в оогенезе на хромосомах ооцита(Баранов, Кузнецова, 2007; Reik, 2007). Переключение индивидуальной генетическойпрограммы с материнской РНК на собственно геном зародыша происходит постепенно(Pesce, Schöler, 2001). Процесс перехода к синтезу собственных мРНК эмбрионапредставляет собой запуск транскрипции эмбрионального генома (т.е.