Отзыв на автореферат 2 (Получение рекомбинантного антагониста рецептора интерлейкина 36 человека и изучение его физико-химических и биологических свойств)

отзыв на автореферат диссертации Алексея Александровича Колобова «Получение рекомбинантного антагониста рецептора интерлейкина 36 человека и изучение его физико-химических и биологических свойств», представленную на соискание ученой степени кандидат биологических наук по специальности 03.01.04- биохимия Псориаз является достаточно широко распространенным и тяжелым заболеванием. Поэтому поиск эффективных способов лечения этого заболевания является важной и актуальной задачей. В последние годы появились данные, свидетельствующие о том, что некоторые цитокины играют важную роль в развитии псориаза и зачастую определяют тяжесть протекания этого заболевания.

В частности, было высказано предположение, что блокада рецептора интерлейкина 36 (ИЛ-36) может быть многообещающим подходом для лечения этого вида дерматоза. В этой связи тема диссертационной работы А.А. Колобова, посвященной разработке метода получения рекомбинантного антагониста рецептора ИЛ-36 и исследованию его некоторых физико-химических свойств, представляется в высшей степени актуальной и важной. На первой стадии своего исследования диссертант получил штаммы Е.со(Б содержащие плазмиду рЕТЧ136йат и способные экспрессировать в достаточно больших количествах антагонист рецептора ИЛ-ЗБ. Однако оказалось, что в этом случае до 60% получаемого белка содержат в своем составе инициаторный остаток формилметионина, и такая форма белка не обладает биологической активностью.

Па этой причине возникла необходимость коэкспрессии в клетках Е.сой дополнительного фермента, а именно метионинаминопептидазы, способной удалять инициаторный остаток формилметионина. Автор использовал три плазмиды с контролем экспрессии под действием лактозы, рамнозы и арабинозы. Вводя в клетки Е.со!( две плазмиды, кодирующих антагонист рецептора ИЛ-36 и метионинаминопептидаэу, автор сумел получить препараты антагониста рецептора интерлейкина полностью лишенных начального остатка формилметионина, Это является несомненным достижением диссертанта.

Возникает вопрос, почему в своей работе диссертант использовал две разных плазмиды, нельзя ли было получить полицистронную плазмиду, последовательность которой содержала бы информацию как о целевом белке, так и о метионинаминопептидазе. Продолжая свое исследование, А.А. Колобов сравнил эффективность экспрессии антагониста рецептора ИЛ-36 в разных штаммах Е.сой и приступил к масштабированию процесса культивирования и получения полупрепаративных количеств целевого белка. В ходе выполнения этой части работы проводилась оптимизация условий культивировании бактерий, условий и срока добавки индукторов, а также совершенствовались методы очистки от липополисахаридов. При этом подбирались наиболее эффективные и технологичные подходы для решения этих непростык задач.

Анализируя препараты очищенного белка, диссертант утановил их микрогетерогенность, выявляемую при изозлектрическом фокусировании и электрофорезе. Было высказано предположение, что зта микрогетерогенность является следствием химической модификации аминокислот, происходящей в ходе выделения или хранения препарата белка, Белок был проинкубирован при щелочных значениях рН и/или подвергнут окислению под действием перекиси водорода. Оказалось, что после инкубации при щелочных значениях рН в препарате белка накапливается модифицированная форма, имеющая более низкое значение изозлектрической точки и обладающая измененной электрофоретической подвижностью.

Автор приходит к заключению, что в ходе выделения (и/или хранения) белок подвергается дезамидированию и предсказывает, какой остаток аспарагина может подвергаться этой модификации, Мне кажется, что это заключение не является бесспорным. Было бы желательным провести массспектрометрическое определение молекулярной массы модифицированного белка и показать, что убыль его массы точно соответствует удалению аминогруппы, а не связано, например, с окислением остатков цистеина и/или метионина, которое легко происходит при щелочных значениях рН (рН 9,0), которые были использованы в ходе работы, Как бы то ни было, в ходе выполнения работы было четко показано, что инкубация белка при щелочных значениях рН может приводить к микрогетерогенности. По это причине были внесены изменения в протокол выделения белка и был понижен рН на стадиях очистки белка на О- сефарозе и при хранении конечного препарата белка.

Заключительные разделы автореферата, имеющие более биотехнологическую, чем биохимическую направленность, касаются методов очистки целевого белка от липополисахаридов и масштабирования лабораторного производства. В ходе выполнения этой части работы диссертант сумел разработать эффективные методы масштабирования лабораторного производства и привести подробное описание этапов пилотного промышленного производства.

Несомненным достоинством этой части работы является тот факт, что в ходе выполнения этой части исследования А.А. Колобов сумел предложить высокоэффективный метод получения рекомбинантнога антагониста рецептора ИЛ-36 и дал рекомендации ,.х .l Николай Борисович Гусев Член-корреспондент РАН, доктор биологических наук по специальности 03.01.04 биохимия профессор кафедры биохимии биологического факультета Федерального Государственного бюджетного образовател образования «Московский государственный университет им о профессионального Ленинские Горы дом 1 корп.

12, Москва, 119234 Телефоны:7-495-939-2747;8-495-939-27-76, Факс 8.495-939-43-09 е-птаК: Я'боьетшпта~Ои; е1оггзгпа~!.Ыо,газо,п~ е Я, ЗА'ЗпРЯЮ ' —;--":"' ':югуузк т,.ззг бгхдагкч~схвго ф . Вы«23 БВГУ по хранению и возможному использованию полученного препарата в медицинской практике. Завершая анализ диссертационной работы А.А. Колобова, можно заключить, что она посвящена интересной и актуальной проблеме, выполнена на высоком научном уровне и содержит оригинальные данные. Важно отметить, что помимо теоретического интереса, данное исследование представляется очень важным и с практической точки зрения. Можно надеяться, что результаты, полученные при выполнении этого исследования, будут со временем использоваться в медицинской практике.

Судя по автореферату диссертационная работа Алексей Александровича Колобова «Получение рекомбинантного антагниста рецептора интерлейкина 36 человека и изучение его физико-химических и биологических свойствя соответствует требованиям, предъявляемым к кандидатским диссертациям, выдвигаемым "Положением о присуждении ученых степеней" (утверждено Постановлением Правительства РФ от 24.09.2013 г. Кз 842 с изменениями Постановления Правительства РФ от 21.04.2016 г.

КВ335, в ред. Постановления Правительства РФ от 02.08.2016 г. К9748), а ее автор заслуживает присвоения ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.01.04- биохимия. .