Диссертация (Генетические и эпигенетические особенности генома сперматозоида и их влияние на ранее эмбриональное развитие человека), страница 9

При этом бесплодие встречается и у мужчин с нормальнымипоказателямиспермограммы(AgarwalandAllameneni,2004).Развитиеметодоввспомогательных репродуктивных технологий позволяет преодолеть проблему бесплодия.Тем не менее, только 30% попыток экстракорпорального оплодотворения заканчиваютсярождением ребенка (Кулаков с соавт., 2005). Методика искусственного оплодотворенияпозволяет  доставитьгенетическийматериалсперматозоидавяйцеклетку,минуя  34  естественные барьеры.

Именно поэтому важно учитывать качество генетического материалагамет, отобранных для оплодотворения. И наряду со стандартной спермограммой оценкацелостности ДНК дает представление о качестве сперматозоидов.Фрагментация ДНК определяется наличием/отсутствием однонитевых и двунитевыхразрывов. Основными причинами фрагментации ДНК сперматозоидов считаются нарушениекомпактизации хроматина в процессе спермиогенеза, окислительный стресс и апоптоз.1.5.1. Нарушение компактизации хроматина созревающего сперматозоида      Результатом сперматогенеза является формирование высокоспециализированнойполовой клетки — сперматозоида.

На заключительном этапе сперматогенеза происходитсозревание сперматид: формируются основные морфологические структуры сперматозоида,удаляется цитоплазма. Определенные изменения происходят и с хроматином созревающейгаметы, в результате чего объем ядра уменьшается в 6 раз по сравнению с объемом ядрасоматической клетки (Andrabi, 2007). Конденсация хроматина происходит за счетспецифических белков ядерного матрикса и замены гистоновых белков на протамины.

Всперматозоидах человека не все гистоновые белки замещаются на протамины. До 10-15%остаточных гистонов в ядре сперматозоида расположены не случайным образом: в генах,которые должны быть доступны для транскрипции сразу после оплодотворения, например, впромотерах генов, кодирующих некоторые сигнальные белки, контролирующих раннееэмбриональное развитие, генах ТФ, а также в импринтированных генах и в ДНК - матрицахдля синтеза регуляторных микроРНК (Bench et al., 1996).Протамины — основные белки, молекулярная масса которых вдвое меньшемолекулярной массы гистоновых белков (5-8 kDa). До 79% аминокислотных остатков вмолекуле протамина представлено аргинином. Являясь высоко основной аминокислотой,аргинин образует ионные связи с фосфатными группами ДНК, что способствует болеетесному связыванию и, следовательно, более плотной упаковке ДНК в структуру,называемую тороидом.

Помимо аргинина, значительное количество аминокислотныхостатков в молекуле протамина представлено цистеином. Цистеин играет важную роль вобразовании дисульфидных связей в процессе дозревания сперматозоида в придатке яичка(Andrabi, 2007).    35  Замещение гистоновых белков на протамины сопровождается разрезанием ипоследующим восстановлением структуры ДНК. Топоизомераза II является эндогеннойнуклеазой, которая вносит разрывы в ДНК, необходимые для снятия торсионногонапряжения, а также обеспечивает последующее лигирование ДНК с образованиемпромежуточной структуры – интермедиата (фермент + 5' конец ДНК) (McPherson and Longo,1993). Поскольку сперматиды являются гаплоидными клетками, то репарация разрывов ДНКпо типу гомологичной рекомбинации из-за отсутствия сестринской хроматиды невозможна.Вероятно, репарация повреждений ДНК происходит иными путями, например, с помощьюнегомологичного воссоединения концов (NHEJ), однако точные пути репарации ДНК всперматидах до сих пор остаются неизученными (Zini and Agarwal, 2011).В норме в придатке яичка в ходе дозревания сперматозоида целостность ДНКполностью восстанавливается.

Наличие разрывов в ДНК сперматозоида после дозревания впридатке яичка свидетельствует о нарушении упаковки ДНК и незавершенности процессадозревания гаметы (Erenpreiss et al., 2001).Нарушение процесса замены гистонов на протамины, а также изменение соотношенияпротаминов разных типов приводит к снижению фертильности (Carrell et al., 2007).Нерепарированные разрывы ДНК нарушают структуру хроматина половой клетки,делают ее более чувствительной к действию повреждающих агентов. Например, показано,что употребление алкоголя и курение приводит к увеличению доли сперматозоидов сфрагментированной ДНК (Zini and Agarwal, 2011).1.5.2. Повреждение ДНК сперматозоида в результате действия АФК      Окислительный стресс представляет собой процесс повреждения клетки продуктамиокисления – ROS (reactive oxygen species). ROS или Активные Формы Кислорода (АФК) –метаболиты, возникающие в результате восстановления молекулярного кислорода. АФКявляются основными компонентами, участвующими в нарушении окислительно восстановительного статуса клетки.

К АФК относят супероксид О2-, пероксид водорода Н2О2,пероксильные радикалы ROO., гидропероксид ROOH, пероксинитриты ONOO-, оксид азота(II). АФК могут взаимодействовать друг с другом, например, при взаимодействии О2- и Н2О2в присутствии металлов, железа или меди, которые могут менять свою валентность,происходит образование О2-. АФК способны эффективно окислять белки, липиды и    36  нуклеиновые кислоты. Присутствие АФК необходимо для стимуляции пролиферации идифференцировки клеток, однако увеличение их концентрации вызывает окислительныйстресс,который,какполагают,являетсяоднойизважныхпричиннарушениярепродуктивной функции у мужчин.

АФК повреждают полиненасыщенные жирные кислотыплазматической мембраны (ПМ) сперматозоида. Двойные связи полиненасыщенных жирныхкислот легко вступают во взаимодействие с АФК, запуская каскад перекисного окислениялипидов, что приводит к нарушению целостности ПМ сперматозоида и, как следствие этого,кнарушениямподвижностисперматозоида,дефектамакросомнойреакциииоплодотворения (Gharagozloo and Aitken, 2011).Другой мишенью АФК является ДНК сперматозоида. Так же как и в случаеперекисного окисления липидов в присутствии металлов с переменной валентностьюобразуется гидроксильный радикал.

Последний реагирует с сахарами, пуриновыми ипиримидиновыми основаниямиДНК. Так, модифицированное основание 8-гидрокси-2-дезоксигуанозин (8-OH-dG) является одним из метаболитов, возникшимприсоединениягидроксильногорадикалакатомууглеродав результатегуанина.Появлениемодифицированных в результате окисления оснований ДНК дестабилизирует гликозидныесвязи между апуриновыми или апиримидиновыми основаниями и остатком сахара.Возникающие апуриновые или апиримидиновые сайты, в свою очередь, дестабилизируютструктуру ДНК, приводя к появлению разрывов (Gharagozloo and Aitken, 2011).Антиоксиданты представляют собой ингибиторы окисления. К естественнымантиоксидантамотносятα-токоферол,витамин,способныйэффективносвязыватьпероксильный и алкоксильный радикалы, образующиеся в результате перекисногоокисления липидов ПМ (Suleiman et al., 1996). К антиоксидантам относятся такиекомпоненты семенной плазмы как витамин С, триптофан, таурин, мочевая кислота (Rhemrevet al., 2000).Компонентамицитоплазматическаяантиоксидантнойизащитымитохондриальнаяформысперматозоидаявляютсясупероксиддисмутазытакже(SOD)иклеткойсглутатионпероксидазы (GPX), а также редуктазы.Посколькусперматозоидявляетсявысокоспециализированнойминимальным количеством цитоплазмы, внеклеточная антиоксидантная защита являетсяосновной в период дозревания сперматозоида в придатке яичка.

Снижение уровняантиоксидантной защиты секрета половых желез приводит к снижению фертильности,причиной которого является появление разрывов ДНК сперматозоидов вследствиеокислительного стресса. С другой стороны, снижение антиоксидантного потенциаласеменной жидкости может быть следствием окислительного стресса.

Иными словами, АФК,    37  генерируемые сперматозоидами в результате нарушенияработы электрон-транспортнойцепи митохондрий или NADPH-оксидазного комплекса плазматической мембраны, снижаютуровень антиоксидантов в семенной жидкости (Zini and Agarwal, 2011).1.5.3. Апоптоз в процессе сперматогенеза  Апоптозявляетсяосновныммеханизмомклеточнойгибеливпроцессесперматогенеза. В норме в 75% мужских половых клеток на стадии сперматогонийзапускается процесс апоптоза (Milligan and Schwartz, 1997).Апоптоз, как генетически запрограммированная клеточная гибель, характеризуетсярядом морфологических и биохимических изменений, включающих: уменьшение объемаклетки, вздутие цитоплазматической мембраны, конденсацию и преимущественнуюлокализацию хроматина на внутренней поверхности ядерной мембраны, так называемуюмаргинацию, а также формирование апоптотических телец.

Воспалительный процесс приапоптозе не развивается, поскольку происходит быстрый фагоцитоз клеток. Характернойчертой апоптоза является экстернализация фосфатидилсерина с внутреннего на внешнийлисток плазматической мембраны клетки, результатом чего является её повышеннаяпроницаемость. Изменяется и трансмембранный потенциал митохондрий. В результатеизмененияпроницаемостимембранмитохондрийоткрываютсяионныеканалы,вцитоплазму клетки выходят такие факторы индукции апоптоза, как AIF (apoptosis-inducingfactor).