Диссертация (Экспрессия генов транскрипционных факторов LXRalpha, LXRbeta, PPARgamma и транспортера ABCA1 при атеросклерозе), страница 2

К данному семейству относятся печеночные Хрецепторы (LXR) – LXRα и LXRβ и рецептор активации пролиферации пероксисом(PPAR) γ, которые играют ключевую роль в регуляции энергообмена и липидногообмена (Wahli et al., 2012). Было показано, что данные ядерные рецепторыэкспрессируются в макрофагах и в пенистых клетках в местах атеросклеротическихпоражений (Apostoli et al., 2012, Kiss et al., 2013) и их экспрессия может критическивлиять на функции макрофагов, включая их активацию, продукцию цитокинов и их9преобразование в пенистые клетки, что, в свою очередь, влияет на развитиеатеросклероза.Вместе с тем стабильность атеросклеротической бляшки также играетключевую роль в прогрессировании развития атеросклероза и его осложнений. Вряде исследований был отмечен повышенный уровень экспрессии гена матричнойметаллопротеиназы (ММР)-9 в атеросклеротических бляшках (Chen et al., 2005) иполученыданные,чтоаккумуляцияMMP-9макрофагамиприводиткфрагментации атеросклеротического кора и формированию осложненной атеромы(Morishige et al., 2003).

В этой связи, особый интерес уделяется роли экспрессиигена MMP-9 в макрофагах, что может пролить свет на его влияние на патогенезатеросклероза.На основе анализа литературных данных было сделано предположение, чтоварианты гена АВСА1 и уровень экспрессии гена ABCА1, а также уровеньэкспрессии генов ядерных рецепторов LXRα, LXRβ, PPARγ и гена MMP-9 вмакрофагах могут быть ассоциированы с развитием атеросклероза. Эта гипотезапослужила основой для проведения настоящего исследования.Цель исследованияЦель работы заключалась в оценке вклада вариантов гена АВСА1, уровнямРНК генов ABCА1, LXRα, LXRβ, PPARγ и MMP-9 и уровня белка ABCА1 вразвитие атеросклероза.Задачи исследования1.Определить частоту вариантов гена АВСА1 (R219K, 319ins<G,(-17)G>C) в группе пациентов с атеросклерозом и контрольной группе.2.Определить уровень мРНК генов ABCА1, LXRα, LXRβ, PPARγ иMMP-9 в макрофагах, активированных М-CSF, у пациентов с атеросклерозом и улиц без сердечно-сосудистой патологии.103.Провести сравнительный анализ уровня белка ABCA1 в макрофагах,активированных М-CSF, у пациентов с атеросклерозом и у лиц без сердечнососудистой патологии.4.Провести анализ корреляции между исследованными уровнями мРНКгенов ABCА1, LXRα, LXRβ, PPARγ, MMP-9, уровнем белка ABCA1.5.Провести анализ ассоциации уровня мРНК генов ABCА1, LXRα, LXRβ,PPARγ и MMP-9 и уровня белка ABCA1 с содержанием липидов в плазме крови упациентов с атеросклерозом и у лиц без сердечно-сосудистой патологии.Научная новизна полученных результатовДана оценка частоты вариантов гена АВСА1 (R219K, 319ins<G, (-17)G>C) ужителей Санкт-Петербурга и впервые показано, что вариант G319 гена АВСА1снижает относительный риск развития атеросклероза.

Впервые проведен анализэкспрессии генов ABCА1, LXRα, LXRβ, PPARγ, MMP-9 и уровня белка ABCА1 вмакрофагах, стимулированных М-CSF, у пациентов с атеросклерозом и у лиц безсердечно-сосудистой патологии. Выявлено повышение уровня мРНК ABCА1 иMMP-9 в макрофагах больных атеросклерозом по сравнению с контрольнойгруппой. Впервые показано снижение уровня мРНК LXRβ и PPARγ в макрофагахгруппы пациентов с атеросклерозом по сравнению с контрольной группой.Впервые установлено, что содержание белка ABCA1 в макрофагах у пациентов сатеросклерозомнижепосравнениюсконтрольнойгруппой.Впервыепродемонстрирована корреляция между уровнем мРНК гена MMP-9 и уровнембелка ABCA1 в макрофагах у пациентов с атеросклерозом.Практическая значимость работы:Полученные экспериментальные данные вносят вклад в пониманиемолекулярно-генетическихосновнаследственнойпредрасположенностикатеросклерозу.

Типирование варианта 319ins<G гена АВСА1 может бытьиспользовано для оценки прогноза развития атеросклероза. Выявленные измененияв уровне экспрессии генов ABCА1, LXRβ, PPARγ и MMP-9 и позволяют11приблизиться к пониманию роли уровня экспрессии данных генов в патогенезеатеросклероза. Гены, для которых были обнаружены изменения в уровнеэкспрессии, могут рассматриваться в качестве значимых факторов в развитииатеросклероза. Оценка уровня их экспрессии может представлять интерес дляформирования групп риска в профилактике атеросклероза.Основные положения, выносимые на защиту:1.Вариант G319 гена АВСА1 снижает риск развития атеросклероза ужителей Санкт-Петербурга.2.Уровень мРНК генов ABCА1 и MMP-9 в макрофагах, активированныхМ-CSF, пациентов с атеросклерозом повышен по сравнению с контрольнойгруппой.3.Уровень мРНК генов LXRβ и PPARγ снижен в макрофагах,активированных М-CSF, пациентов с атеросклерозом по сравнению с контрольнойгруппой.4.Содержание белка ABCA1 в макрофагах, активированных М-CSF, упациентов с атеросклерозом ниже по сравнению с контрольной группой.5.Существует прямая корреляция между уровнем мРНК гена ABCA1 вмакрофагах, активированных М-CSF, и уровнем холестерина в составе ЛПВПплазмы крови в контрольной группе.6.Существует обратная корреляция между уровнем мРНК гена MMP-9 иуровнем белка ABCA1 в макрофагах, активированных М-CSF, у пациентов сатеросклерозом.12Личное участие автора в получении результатов, изложенных вдиссертации:Основная часть экспериментальной работы, планирование экспериментов,описание собственных исследований, анализ и обсуждение результатов выполненыавтором самостоятельно.

Осмотр и ангиографическая диагностика атеросклероза упациентов, забор у них периферической крови, измерения концентрации липидовплазмы крови осуществлялись сотрудниками ПСПбГМУ им ак. И.П. Павлова, чтонашло отражение в совместных публикациях. Культивирование макрофагов,активированных М-CSF, проведены совместно с сотрудником ФГБУ «ПИЯФ»Мирошниковой В.В., что нашло отражение в совместных публикациях.Степень достоверности и апробация результатов.Результатыработыимеютвысокуюстепеньдостоверности,подтвержденную методами статистического анализа, публикацией в 4 статьях врецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, и 14 тезисных сообщениях.Материалы диссертации были доложены и обсуждены на: Европейскойконференции по генетике человека, Барселона, Испания, 2008 г., Международнойконференции «Биология: от молекулы до биосферы», Харьков, Украина, 2008 г., VСъезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Москва, 2009 г., 3-емконгрессе FEBS «ABC Proteins», Инсбрук, Австрия, 2010 г., 4-ом Международнойконференции молодых ученых ИМБ «Молекулярная биология: проблемы иперспективы», Киев, Украина, 2011 г., Российском национальном конгрессекардиологов, Санкт-Петербург, 2013 г., Европейском конгрессе обществаатеросклероза (EAS) – Гамбург, Германия, 2010 г., Милан, Италия, 2012 г., Мадрид,Испания, 2014 г..13Структура и объем диссертации:Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введения, глав«Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и Обсуждение»,«Выводы» и списка литературы (195 наименований).

Работа изложена на 116страницах машинописного текста, иллюстрирована 5 таблицами, 22 рисунком ифотографиями.14Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ1.1 Патогенез атеросклероза. Роль липопротеинов1.1.1 Факторы риска развития атеросклерозаССЗ, обусловленные атеросклерозом, по данным эпидемиологическихисследований, являются основной причиной смерти во всем мире, в том числе и вРоссии (Roger et al., 2012; ВОЗ. Ситуация в области неинфекционных болезней встранах на 2011 г. Глобальный доклад ВОЗ, 2011). Атеросклероз (от греч. ἀθέροςathere, «мякина, кашица» и σκληρός sklerosis, «уплотнение, затвердение») согласноопределению Всемирной Организации Здравоохранения, – это вариабельнаякомбинация изменений интимы артерий, включающая накопление липидов,сложных углеводов, фиброзной ткани, компонентов крови, отложение кальция исопутствующие изменения средней оболочки артериальной стенки.

Отложенияформируются в виде атероматозных бляшек. Последующее разрастание в нихсоединительной ткани (склероз) и обызвествление стенки сосуда приводят кдеформации и сужению просвета вплоть до облитерации артерии. Частотавстречаемости многоочагового атеросклероза варьирует от 18 до 54% (Чернявскийи др., 2006).

Патогенез атеросклероза представляет собой многофакторныйпроцесс, этиопатогенетические механизмы которого остаются в настоящее времяне до конца выясненными. Предполагается, что в основе патогенеза лежатследующие факторы, а также их сочетания:•инфильтрация липопротеинов в стенке сосудов,•дисфункция эндотелия — первичное нарушение защитныхсвойств эндотелия и его медиаторов,•аутоиммунные нарушения — первичное нарушение функциимакрофагов и лейкоцитов, инфильтрация ими сосудистой стенки,•первичное вирусное повреждение эндотелия,15•Средипервичное нарушение антиоксидантной системы (Орехов, 2013).причинразвитияатеросклерозавыделяютигенетическуюпредрасположенность.