Диссертация (Экспрессия генов транскрипционных факторов LXRalpha, LXRbeta, PPARgamma и транспортера ABCA1 при атеросклерозе), страница 8

Исследования, выполненные на мышах, подтверждают, чтоагонист LXR Glaxo GW3965 значительно повышает уровень ОТХ (Naik et al., 2006).Другой агонист LXR, Tularik TO901317, как было выявлено, существенно снижаетразмер атеросклеротической бляшки в линии мышей с отсутствием рецептораЛПНП -/-, являющихся моделью атеросклероза, и этот процесс является LXRзависимым (Michael et al., 2012).

Кроме того, Tularik TO901317 ингибируетинициацию и развитие атеросклеротической бляшки и активирует регрессию ужесуществующей атеросклеротической бляшки у мышей линии апо Е*3-Лейден привысоко холестериновой диете (Michael et al., 2012).451.5.2.3 Роль LXR в макрофагахКак было уже отмечено выше, макрофаги играют ключевую роль вметаболизме липидов и в обменных процессах при атеросклерозе (Rader, Pure,2005).LXR являются регуляторами гомеостаза холестерина в макрофагах, ОТХ иабсорбции холестерина в кишечнике (Bensinger, Tontonoz, 2008; Chinetti-Gbaguidi,Staels, 2009; Oosterveer et al., 2010).

Избыточное накопление холестеринамакрофагами в местах атеросклеротических поражений преобразует их в пенистыеклетки,являющиесянепосредственнымипредшественникамиатеросклеротических повреждений. Стимулируя ОТХ, LXR может снижатьобразование пенистых клеток и уменьшать содержание холестерина в макрофагах(Valledor, Ricote, 2004). Недавние исследования показали, что PPARγ повышаетуровень экспрессии LXR, что, в свою очередь, приводит к повышенному уровнюABCA1 в макрофагах (Chawla et al., 2001).При развитии атеросклероза основная роль LXR заключается в контролеобразования макрофагами пенистых клеток, обусловленном захватом макрофагамиЛПНП в субэндотелиальном слое артерии через скавенджер-рецепторы (McLarenet al., 2011). Кроме того, в исследованиях in vitro также было отмечено, чтоактивации LXR в первичных макрофагах человека индуцирует поглощение эфировхолестерина из ЛПВП (Michael et al., 2012).1.5.2.4 Антиатерогенные и противоспалительные эффекты LXRМножество исследований in vivo подтверждают антиатерогенную роль LXR.При двойном нокауте LXR-α/-β у мышей происходит увеличение накопленияпенистых клеток в аорте после 18 месяцев нормальной диеты (Schuster et al., 2002).В макрофагах с двойным нокаутом LXR-α/-β показано повышенное накоплениехолестерина (Tangirala et al., 2002).

Кроме того, трансплантация костного мозгаLXR- / - мышей, используемая для генерации макрофагов с отсутствием LXR,46приводит в результате сильному увеличению размеров атеросклеротическихпоражений и накоплению липидов (Tangirala et al., 2002).Было показано, что у мышей с гиперэкспрессией LXRα в макрофагахнаблюдается сокращение на 83% размеров атеросклеротических поражений иувеличивается экспрессия ABCA1 и ABCG1 (Teupser et al., 2008). УвеличениеэкспрессииLXRвмакрофагахуменьшалоразмератеросклеротическогоповреждения на 30% и повышало экспрессию макрофагами апо Е и ABCA1.Одновременно с этим было отмечено снижение уровня триглицеридов на 50% пригиперэкспрессии LXR в макрофагах мышей с отсутствием рецептора ЛПНП -/-,которые являются моделью атеросклероза (Li et al., 2011). Кроме того,индуцированная гиперэкспрессия LXRα в макрофагах у мышей с отсутствиемрецептора ЛПНП -/- приводит к уменьшению атеросклеротических бляшек изначительному увеличению оттока холестерина из клеток (Teupser et al., 2008).

Вработе Lo Sasso и соавт. было продемонстрировано, что у мышей с отсутствиемрецептора ЛПНП -/- индукция LXRα в кишечнике приводит к сокращениюкишечной абсорбции холестерина, усилению ОТХ и, в результате, к замедлениюразвития атеросклероза (Lo Sasso et al., 2010).LXR могут играть ключевую роль в ответах на воспаление. Активация LXRослабляет воспаление и экспрессию воспалительных генов во многих клеточныхтипах – макрофагах, CD-позитивных лимфоцитах, микроглии, астроцитах (Michaelet al., 2012).

Было показано, что LXR ингибируют продуцирование TNFα и IL-1βиэкспрессию таких воспалительных медиаторов как СОХ2, iNOS, IL-6 (Steffensen etal., 2004).Таким образом, многочисленными исследованиями показано, что уровеньэкспрессии LXRα и LXRβ может учитываться в качестве фактора, влияющего наразвитие атеросклероза.Развитие атеросклеротических поражений включает в себя сложноевзаимодействие между различными про- и анти-атерогенными процессами.

В47последнее время, с появлением трансгенных моделей атеросклероза стали активноизучатьсямеханизмывлиянияуровняэкспрессиигеновнаразвитиеатеросклеротических поражений и основанное на этом прогрессированиезаболеваний сосудистой системы. Из совокупности вышеприведенных данныхможно сделать вывод, что определение уровня мРНК генов PPARγ, LXRα, LXRβ,MMP-9 и ABCА1 и уровня белка ABCА1 в макрофагах могут вносить вклад впонимание наследственной предрасположенности к атеросклерозу.

Именно этойпроблеме посвящено настоящее исследование.48Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ2.1 Характеристика обследованных групп.В соответствии с поставленными задачами были выбраны следующиегруппы:пациентысатеросклерозом,подтвержденнымнаоснованииангиографического исследования и соответствующая контрольная группа. Лица,вошедшие в группу пациентов с атеросклерозом и контрольную группу являлисьпредставителями европеоидной расы, проживали в Северо-Западном регионеРоссийской Федерации и не были связаны узами родства. Проведение настоящейработы было одобрено этическим комитетом Первого Санкт-Петербургскогогосударственного медицинского университета имени академика И.П.

Павлова.Для оценки вклада вариантов гена АВСА1 в развитие атеросклероза былаотобрана группа пациентов, которая состояла из 119 человек (79.0% мужчин и21.0%женщин)сатеросклерозом,подтвержденнымангиографическимисследованием (средний возраст – 51.41±6.21 года). Первые клиническиепроявления атеросклероза у пациентов наблюдались в возрасте 47.87±7.05 лет.Обследованиеиангиографическуюдиагностикуартериальногостеноза,отражающего атеросклеротические изменения в сосудах, проводили в ПервомСанкт-Петербургскомгосударственноммедицинскомуниверситетеимениакадемика И.П. Павлова.

Локализация пораженных атеросклерозом артерий былакак минимум в одной артерии одного из трех артериальных бассейнов(церебральный, коронарный или бассейн артерий нижних конечностей). Группабольных была гетерогенной по степени локального (% окклюзии артерииатерогенной бляшкой) и диффузного (общее количество артерий, пораженныхатеросклерозом) атеросклероза. Пациенты, вошедшие в выборку, не принимали нистатинов, ни каких-либо иных гиполипидемических средств.Контрольная группа состояла из 300 человек (63% мужчин и 37% женщин)без ССЗ в анамнезе и соответствовала группе пациентов по полу и возрасту(средний возраст 45.60±6.30 года). Возраст контрольной группы соответствовал49возрасту начала заболевания у пациентов.

Данная выборка является случайной ипринадлежит к тому же географическому региону, что и включенная в анализгруппа лиц больных атеросклерозом. Все лица, вошедшие в контрольную группу,проходили обследование врача кардиолога и проведенные обследования данныхлиц включали электрокардиографию, велоэргометрию и ЭХО кардиографию.Для оценки вклада уровня мРНК генов PPARγ, LXRα, LXRβ, MMP-9 и ABCА1и уровня белка ABCА1 в развитие атеросклероза была отобрана группа пациентов,котораясостоялаиз15мужчинсатеросклерозом,подтвержденнымангиографическим исследованием (средний возраст – 53.87±6.78 года).

Первыеклинические проявления атеросклероза у пациентов наблюдались в возрасте47.73±4.33 лет. Обследование и ангиографическую диагностику артериальногостеноза, отражающего атеросклеротические изменения в сосудах, проводили вПервом Санкт-Петербургском государственном медицинском университете имениакадемика И.П. Павлова. Пораженные атеросклерозом артерии располагались вкоронарном бассейне.

На рисунках 6 и 7 представлены ангиограммы двухпациентов с различной степенью стеноза коронарных артерий. Однако у всехбольных был выявлен стеноз более 50% как минимум в одной артерии коронарногобассейна. Пациенты, вошедшие в выборку, не принимали ни статинов, ни какихлибо иных гиполипидемических средств.Контрольная группа состояла из 19 человек без ССЗ в анамнезе исоответствовала группе пациентов по полу и возрасту (средний возраст –52.05±6.05лет). Все представители контрольной группы проходили обследованиеврача кардиолога.

Данная выборка является случайной и принадлежит к тому жегеографическому региону, что и включенная в анализ группа лиц больныхатеросклерозом.50Рисунок 6. Ангиограмма пациента. Показан 99% стеноз ствола левойкоронарной артерии.Рисунок 7. Ангиограмма пациента. Показаны: 1- стеноз 50% и 3 – стеноз99% передней межжелудочковой артерии; 2 – стеноз 75% огибающей ветви левойкоронарной артерии.51У всех пациентов и представителей контрольной группы измерялиэнзиматическим методом с использованием наборов ByoSystems (Испания)концентрацию общего холестерина (ОХ) и Х-ЛПВП в плазме крови. Уровень ОХсыворотки крови и Х-ЛПВП выражали в ммоль/л.2.2 Выделение ДНК из периферической крови человекаВыделение ДНК проводили из венозной крови, забранной из локтевой веныв объеме 5 мл в стерильные пластиковые пробирки, содержащие 50 мкл 0.5М ЭДТАрН=8.0 как антикоагулянта.

Собранная данным образом кровь подвергаласьзамораживанию и хранилась при температуре -20°С. ДНК выделяли из лейкоцитовкрови стандартным фенол-хлороформным методом (Маниатис и соавт., 1984).Лизис клеточных элементов крови проводили по методу Канкеля (Lahiri et al.,1992): к 500 мл крови добавляли 500 мкл раствора для лизиса эритроцитов (29 мМTris-HCl pH 7.4, 10 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2, 5% сахароза, 1% тритон Х100),инкубироваливтечение5мин.,осторожноперемешивая,изатемцентрифугировали 10 минут при +9°С, 4000 оборотов в минуту.