Диссертация (Экспрессия генов транскрипционных факторов LXRalpha, LXRbeta, PPARgamma и транспортера ABCA1 при атеросклерозе), страница 9

Супернатантсливали и осадок лейкоцитов ресуспендировали в растворе для лизиса клеточныхмембран (29 мМ Tris-HCl pH 7.4, 10 мМ NaCl, 1 мМ MgCl2, 0.25 М сахароза). Смесьцентрифугировали при тех же условиях, супернатант сливали. К осадку добавляли300 мкл раствора для протеиназы К (0.01 М Tris-HCl, 0.01 М NaCl, 0.01 М ЭДТАpH 8.0), 30 мкл 30% додецилсульфата натрия и протеиназу К до ее конечнойконцентрации 100 мкг/мл. Смесь инкубировали в течение 2-3 часов при +50°С дляпротеолиза.

Получившийся в результате гомогенный раствор последовательнообрабатывали 300 мкл фенола, 300 мкл смеси фенола с хлороформом всоотношении 1:1, 300 мкл хлороформа. После каждой экстракции в течение 10 минпри аккуратном перемешивании смесь центрифугировали 10 мин. при +20°С 4000об/мин и отбирали водную фазу. По окончании экстракции к водной фазедобавляли 1/10 объема 3М ацетата натрия и 2 объема 96% этанола. Осадок ДНКцентрифугировали при +9°С, 10000 оборотов в минуту, в течение 10 минут.

Затемосадок дважды промывали 70% этанолом при тех же условиях центрифугирования,52высушивали на воздухе, при комнатной температуре, в течение 12 часов, ирастворяли в 100 мкл стерильной дистиллированной воды. Выход ДНК врезультате такой очистки составлял 40-50 мкг ДНК из 500 мкл цельной крови.2.3 Полимеразная цепная реакция и рестрикционный анализДля типирования исследуемых вариантов гена АВСА1 использовалиамплификацию соответствующих участков ДНК методом полимеразной цепнойреакции (ПЦР) с последующим рестрикционным анализом амплифицированныхфрагментов.ПродуктыПЦРирестрикционногоанализаподвергалиэлектрофоретическому разделению при силе тока 30мА и напряжении 150В вполиакриламидном геле (ПААГ) соответствующей концентрации в трис-боратномбуфере (0.9M Tris-OH, 0.9M борной кислоты, 20мM ЭДТА).

Продолжительностьэлектрофореза определяли по движению в ПААГ красителей ксилен-цианола ибромфенолового синего, входящих в состав буфера для нанесения проб (водныйраствор 0.25% ксилен-цианола, 0.25% бромфенолового синего, 30% глицерина),результаты визуализировали в ультрафиолете после окрашивания бромистымэтидием (Маниатис и соавт., 1984).Использовали аппарат для вертикальногоэлектрофореза VE-4 фирмы "Helicon" (Россия).Последовательности использованных праймеров и зондов (Zwarts et al.,2002) (Бигль, Санкт-Петербург), представлены в Таблице 1Таблица 153R219KFOR 5`- TGACAAGTCTGTGCAATGGA -3`REV 5`- GGCTTAAACTCAGCCACACC -3`FOR 5`-(-17)G>C CTGCTGAGTGACTGAACTACATAAACAGAGGCCGGGTA -3`REV 5`- CCACTCACTCTCGTCCGCAATTAC -3`FOR 5`319ins<G CCCCTCCTGCTTTATCTTTCAGTTAATGACCAGCCCCG -3`REV 5`- ATCCCCAACTCAAAACCACA -3`2.3.1 Идентификация варианта R219K гена ABCA1ПЦР проводили в 15 мкл амплификационной смеси, содержащей 67 мМ TrisHCl, pH 8.8; 16,6 мМ (NH4)2SO4; 1,5 мМ MgCl2; 0.2 мМ каждого из четырехдезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ); 1,5 мкМ каждогопраймера и 1 единицу активности Taq-полимеразы 1мкг геномной ДНК.

Сверхунаносили 20 мкл вазелинового масла для предотвращения испарения раствора.После первоначальной денатурации при 95оС в течение 5 мин. 35 цикловамплификации проводили в следующем температурно-временном режиме:плавление 92оС – 1мин., отжиг 52оС – 1мин., синтез 72оС – 1мин. После завершения35 циклов амплификации проводили заключительный синтез при 72оС в течение 7мин. В результате амплификации получали ПЦР продукт размером 177 п.н.. ЗатемПЦР продукт обрабатывали 1 единицей активности рестриктазы Hag I (Fermentas,Литва) (1ед.) в буфере R (Fermentas, Литва).

Состав буфера: 10 mM Tris-HCl (pH8.5 при 37°C); 10 mM MgCl2; 100 mM KCl; 0,1 mg/ml BSA при 37°С в течение ночи.Фрагменты ДНК подвергали электрофоретическому разделению в 8% ПААГ споследующей окраской бромистым этидием и визуализацией в ультрафиолете(Рисунок 8).54Hag IK 219107 п.н.R 21970 п.н.177 п.н.127а7бРисунок 8. Идентификация варианта R219K (G655A) гена ABCA1 c помощью ПЦРи рестрикционного анализа.а.

Фрагменты, образующиеся при инкубации продукта ПЦР с рестриктазой Hag I:1 – K219 ABCA1; 2 – R219 ABCA1б. Электрофоретическая картина продуктов рестрикционного анализа: 1 – ПЦРпродукт, 2 – маркер молекулярного веса pВR322/BsuRI, 3 – гомозигота RR219, 4 –гетерозигота RK219, 5 – гомозигота KK2192.3.2 Идентификация варианта (-17)G>C гена АВСА1Условия проведения ПЦР описаны выше. Температура отжига праймеров –60 °С.В результате амплификации получался фрагмент размером 161 п.н.. ПЦРпродукт обрабатывали 1 единицей активности рестриктазы (Fermentas, Литва) вбуфере R (Fermentas, Литва).

Состав буфера: 10 mM Tris-HCl (pH 8.5 при 37°C); 1055mM MgCl2; 100 mM KCl; 0,1 mg/ml BSA при 37°С в течение ночи. Фрагменты ДНКподвергали электрофоретическому разделению в 6% ПААГ с последующейокраской бромистым этидием и визуализацией в ультрафиолете (Рисунок 9).Rsa IG (-17)C (-17)124 п.н.37 п.н.161 п.н.129а9бРисунок 9. Идентификация варианта (-17)G>C гена АВСА1 c помощью ПЦР ирестрикционного анализа.а. Фрагменты, образующиеся при инкубации продукта ПЦР с рестриктазой Rsa I: 1– G(-17) ABCA1; 2 – C(-17) ABCA1б. Электрофоретическая картина продуктов рестрикционного анализа: 1 – ПЦРпродукт, 2 – маркер молекулярного веса pВR322/BsuRI, 3 – гомозигота, CС(-17), 4– гетерозигота CG(-17), 5 – гомозигота GG(-17)2.3.3 Идентификация варианта 319ins<G гена ABCA1Условия проведения ПЦР описаны выше.

Температура отжига праймеров –55°С.56В результате амплификации получался фрагмент размером 246 п.н.. ПЦРпродукт обрабатывали 1 единицей активности рестриктазы Sma I (Fermentas,Литва), в буфере Tango (Fermentas, Литва). Состав буфера: 33 mM Tris-ацетат (pH7.9 при 37°C); 10 mM магний-ацетат; 66 mM калий-ацетат; 1 mg/ml BSA, при 25°Св течение ночи. Фрагменты ДНК подвергали электрофоретическому разделению в6% ПААГ с последующей окраской бромистым этидием и визуализацией вультрафиолете (Рисунок 10).N319insG319210п.н.37Iп.н.

1Hag246 п.н.28a8бРисунок 10. Идентификация варианта 319ins<G гена ABCA1 c помощью ПЦР ирестрикционного анализа.а. Фрагменты, образующиеся при инкубации продукта ПЦР с рестриктазой Sma I:1 – N319 ABCA1; 2 – insG319 ABCA1б. Электрофоретическая картина продуктов рестрикционного анализа: 1 – ПЦРпродукт, 2 – маркер молекулярного веса pВR322/BsuRI, 3 – гомозигота NN319, 4 –гетерозигота NG319, 5 – гомозигота GG319572.3 Выделение фракции моноцитов периферической крови.Для создания банка M-CSF макрофагов был осуществлен забор крови вобследованных группах.

Из локтевой вены утром натощак брали 40 мл крови встерильную пластиковую пробирку объемом 50 мл, содержащую 3 мл стерильного3,8% цитрата натрия в 0,15 М изотоническом фосфатном буфере (рН=7,35). Дляполучения макрофагов свежесобранную кровь смешивали в равном соотношении сфосфатно-солевым буферным раствором (PBS). В стерильную пластиковуюпробирку вносили фиколл (р=1.077, БиоЛот, Санкт-Петербург) из расчета 0,5 мл на1млполученнойсуспензиикрови.Смесьнаслаивалинафиколл,центрифугировали (1500 об/мин, 30 мин).

В стерильных условиях пипеткой сграницы раздела плотности отбирали фракцию мононуклеаров. Мононуклеарыпромывали в PBS, центрифугировали (1500 об/мин, 15 мин.). Клетки инкубировалив СО2-инкубаторе (5% СО2 и 95% атмосферного воздуха) при 100% влажностив и37ºС течение 2 ч. После чего следовала трехкратная промывка в PBS иприкрепившиеся к чашкам Петри моноциты культивировали в культуральнойсреде альфаMEM, содержащей 10 % сыворотку крови плодов коровы, 5 мкг/млантибиотиков (пенициллин G и стрептомицин) в присутствие 15 нг/млколониестимулирующего фактора макрофагов M-CSF (R&D Systems, США) в СО2инкубаторе (5% СО2 и 95% атмосферного воздуха) при 100% влажностив и 37ºС втечение 5 суток с ежедневной заменой инкубационной среды.

Клетки отмывали вPBS, центрифугировали, хранили при температуре –86 ºС.2.4 Оценка уровня мРНК генов ABCA1, LXRα, LXRß, PPARγ и MMP-9.Для выделения тотальной мРНК и проведения реакции обратнойтранскрипции использовали наборы RNeasy Minikit (Qiagen, Нидерланды) и cDNAsynthesis kit (Fermentas, Литва). Чистоту РНК оценивали по отношениюпоглощения при длинах волн 260 и 280 нм (критерий чистоты 1.8).Уровень мРНК генов ABCA1, LXRα, LXRß, PPARγ и MMP-9 определялиметодом количественной ПЦР в режиме реального времени с флуоресцентными58зондами TaqMan на приборе CFX96 Touch (BioRad, США). В качествереференсного гена был использован конститутивно экспрессирующийся в клеткахген β-актина (ACTB).

Последовательности праймеров и зондов, использованные вданной работе (Бигль, Санкт-Петербург), представлены в Таблице 2.Таблица 259Нуклеотидные последовательности праймеров и пробПоследовательность праймеровABCA1MMP-9LXRαLXRβPPARγACTBFOR 5`-GGGAGGCTCCCGGAGTT-3`REV 5`-GTATAAAAGAAGCCTCCGAGCATC-3`FOR 5`-CCTGGAGACCTGAGAACCAAT-3`REV 5`-GCCACCCGAGTGTAACCATAG -3`FOR 5`-CTTGCTCATTGCTATCAGCATCTT-3`REV 5`-ACATATGTGTGCTGCAGCCTCT-3`FOR 5`-CTTCGCTAAGCAAGTGCCTG-3`REV 5`-GCAGCATGATCTCGATAGTGG-3`FOR 5` - GATGTCTCATAATGCCATCAGGTT -3`REV 5`- GGATTCAGCTGGTCGATATCACT -3`FOR 5`- CGTGCTGCTGACCGAGG-3`REV 5`-ACAGCCTGGATAGCAACGTACA-3`5`-FAM-RTQ1-3`5`-FAMфлуоресцентной меткойПоследовательность проб, меченныхABCA1 AACTTTAACAAATCCATTGTGGCTCGCCTGT-MMP-9 ACAGGCAGCTGGCAGAGGAATACCTGTACRTQ1-3LXRαLXRβPPARγACTB5` -FAM-TCTGCAGACCGGCCCAACGTG -RTQ13`5` -FAM- CGGGAGGACCAGATCGCCCT-RTQ1-3`5` -FAM- CAGGCCGAGAAGGAGAAGCTGTTGGRTQ1-3`5`-R6G-CCAACCGCGAGAAGATGACCCAGATBHQ1-3`Зонды отжигались на кДНК в местах экзон-экзонных стыков с цельюисключения амплификации геномной ДНК.

Амплификацию проводили в 25 мкл60реакционной смеси, содержащей 16,6 мМ (NH4)2SO4, 20 мМ Tris-HCl pH 8.8, 0.1%тритон X-100, 2.5мМ MgCl2, 0.25 мкМ каждого праймера, 0.7 мкМ каждого зондаTaqMan, 200 мкМ dNTP, 5 единиц активности Taq ДНК полимеразы фирмы«Fermentas» (Литва). После денатурации при 95ºС в течение 10 мин проводили 45циклов амплификации в следующем температурно-временном режиме: плавление– 95 ºС 30 с, отжиг-синтез – 60ºС 30 с. В результате проведения ПЦР сиспользованием зонда на кДНК исследуемого гена и соответствующегореференсного гена ACTB получали кинетические кривые, отображающиенакопление ПЦР-продукта (Рисунок 11).

Измерения для каждой пробы проводилив трех экземплярах. Относительное содержание мРНК генов ABCA, LXRα, LXRß,PPARγ и MMP-9 рассчитывали методом стандартных кривых. Стандартная криваястроилась в каждом эксперименте как для исследуемого гена, так и референсногогена ACTB (Рисунок 12).Количество мРНК ABCA, LXRα, LXRß, PPARγ и MMP-9 нормировали поотношению к мРНК эндогенного гена ACTB, т.е.

делили количество мРНКисследуемых генов, рассчитанное с использованием CFX96 (BioRad, США), наколичество мРНК ACTB. Относительное содержание мРНК исследуемых геноврассчитывали методом стандартных кривых согласно методическим указаниямфирмы-изготовителя.61Рисунок 11. Кинетические кривые, отображающие накопление ПЦРпродукта.Рисунок 12.

Стандартные кривые.622.5 Измерение уровня белка ABCA1.Относительный уровень белка ABCA1 в макрофагах определяли методомвестерн-блоттинга. Для выделения мембранной фракции макрофаги лизировали врастворе следующего состава: 150 мМ NaCl, 1 % Triton X-100, 50 мМ Tris, pH 8,0,5% дезоксихолат натрия, 0,1% SDS, включающем коктейль из ингибиторовпротеаз (Roche, США). Количество общего белка определяли по методу Бредфордс использованием реагентов фирмы «Силекс» (Россия) на спекртрофотометреSmartSpecTMPlus (BioRad, США).