Диссертация (Экспрессия генов транскрипционных факторов LXRalpha, LXRbeta, PPARgamma и транспортера ABCA1 при атеросклерозе)

Национальный исследовательский центр«Курчатовский институт»Федеральное государственное бюджетное учреждение«Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова»На правах рукописиДемина Екатерина ПетровнаЭкспрессия генов транскрипционных факторов LXRalpha, LXRbeta,PPARgamma и транспортера ABCA1 при атеросклерозеСпециальность 03.02.07 – генетикаДиссертацияна соискание ученой степеникандидата биологических наукНаучный руководитель:д.б.н., Шварцман А.Л.Санкт-Петербург20142ОГЛАВЛЕНИЕСПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ......................................................................................... 5ВВЕДЕНИЕ ..................................................................................................................... 7ГЛАВА 1.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................... 141.1 Патогенез атеросклероза. Роль липопротеинов ........................................... 141.1.1 Факторы риска развития атеросклероза ......................................................... 141.1.2 Роль липопротеинов.......................................................................................... 151.1.2.1 Липопротеины низкой плотности .............................................................

161.1.2.2 Липопротеины высокой плотности ........................................................... 171.1.3 Обратный транспорт холестерина ................................................................... 191.2 ABCA1 транспортер ........................................................................................ 211.2.1 Болезнь острова Танжер ................................................................................... 231.2.2 Варианты гена АВСА1 ...................................................................................... 241.2.3 Функции ABCA1 транспортера .......................................................................

271.2.4 Роль ABCA1 транспортера в макрофагах....................................................... 281.2.5 ABCG1 транспортер ......................................................................................... 291.2.6 Индукция транскрипции гена АВСА1 ............................................................. 301.2.7 Пути деградации белка АВСА1 ....................................................................... 321.3 Роль колониестимулирующего фактора макрофагов М-CSF .................... 351.4 Матричная металлопротеиназа-9 .................................................................. 361.5 Ядерные рецепторы ........................................................................................

381.5.1 Семейство PPAR ............................................................................................... 391.5.1.1 Формы PPAR ............................................................................................... 391.5.1.2 PPARγ ........................................................................................................... 401.5.1.3 Роль PPARγ в макрофагах .......................................................................... 4131.5.2 Семейство LXR .................................................................................................

431.5.2.1 Формы LXR ................................................................................................. 431.5.2.2 Регуляция экспрессии LXR ........................................................................ 441.5.2.3 Роль LXR в макрофагах.............................................................................. 451.5.2.4 Антиатерогенные и противоспалительные эффекты LXR ..................... 45ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ..................................................................

482.1 Характеристика обследованных групп. ........................................................... 482.2 Выделение ДНК из периферической крови человека ................................... 512.3 Полимеразная цепная реакция и рестрикционный анализ ......................... 522.3.1 Идентификация варианта R219K гена ABCA1 ............................................... 532.3.2 Идентификация варианта (-17)G>C гена АВСА1 .......................................... 542.3.3 Идентификация варианта 319ins<G гена ABCA1 .......................................... 552.3 Выделение фракции моноцитов периферической крови.

............................ 572.4 Оценка уровня мРНК генов ABCA1, LXRα, LXRß, PPARγ и MMP-9. .......... 572.5 Измерение уровня белка ABCA1........................................................................ 622.6 Статистическая обработка данных. ..................................................................

63ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ........................................................ 653.2 Анализ вклада вариантов гена АВСА1 (R219K, 319ins<G, (-17)G>C) вразвитие атеросклероза .............................................................................................. 693.2 Уровень мРНК гена ABCА1 в макрофагах, активированных М-CSFисследуемых групп ......................................................................................................

723.3 Измерение уровня белка ABCА1 в макрофагах, активированных М-CSF......................................................................................................................................... 7543.4 Уровень мРНК гена MMP-9 в макрофагах, активированных М-CSF висследуемых группах. ................................................................................................. 793.5 Уровень мРНК генов ядерных рецепторов LXRα, LXRβ, PPARγ вмакрофагах, активированных М-CSF .................................................................... 833.6 Корреляция между содержанием липидов в плазме крови и уровнеммРНК ABCА1, LXRα, LXRβ, PPARγ, MMP-9 и уровнем белка ABCA1 ..............

90ВЫВОДЫ ...................................................................................................................... 93СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ......................................................................................... 945СПИСОК СОКРАЩЕНИЙапо АI – аполипопротеин АIапо Е – аполипопротеин Еапо В – аполипопротеин ВИБС – ишемическая болезнь сердцакДНК – комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислотаЛПВП – липопротеины высокой плотностиЛПНП – липопротеины низкой плотностиЛПОНП – липопротеины очень низкой плотностимРНК – матричная рибонуклеиновая кислотао.е. – относительные единицыОТХ – обратный транспорт холестеринап.н.

– пар нуклеотидовПЦР – полимеразная цепная реакцияССЗ – сердечно-сосудистые заболеванияХ-ЛПВП – холестерин липопротеинов высокой плотностиАВСА1 – АТФ-связывающий кассетный транспортер А1ABCG1 – АТФ-связывающий кассетный транспортер G1LXR – печеночный Х рецепторМ-CSF – колониестимулирующий фактор макрофагов6MMP – матричная металлопротеиназаPPAR – рецептор активации пролиферации пероксисомRXR – ретиноидный Х-рецепторSD – стандартное отклонение7ВВЕДЕНИЕАктуальность проблемыАтеросклероз и его осложнения, такие как ишемическая болезнь сердца (ИБС),ишемический инсульт и другие, являются ведущей причиной смертности взрослогонаселения во многих странах мира.

В настоящее время продолжается рост числазаболеваний,обусловленныхатеросклерозом(ВОЗ.Ситуациявобластинеинфекционных болезней в странах на 2011 г. Глобальный доклад ВОЗ). В связис этим, одной из важнейших проблем, стоящих перед медициной, являетсявыявление групп повышенного риска сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) исоздание на этой основе эффективной системы их профилактики и лечения. В своюочередь, решение этих задач невозможно без глубокого понимания причин имеханизмов развития атеросклероза.В настоящее время атеросклероз рассматривают как многофакторноезаболевание, представляющее собой сложный многоэтапный патологическийпроцесс, этиопатогенетические механизмы которого остаются не до концавыясненными.

Болезнь развивается на основе тесного взаимодействия как внешнихповреждающих, так и генетических факторов. Одной из актуальных проблемсовременной медицины является выяснение молекулярно-генетических основнаследственной предрасположенности к атеросклерозу.На молекулярно-клеточном уровне ключевым компонентом в атерогенезеявляется накопление нагруженных холестерином макрофагов, внутриклеточныхлипидов,внеклеточногоматриксаиснижениеуровняантиатерогенныхлипопротеинов высокой плотности (ЛПВП) (Feig et al., 2008).Предполагается, что обратный транспорт холестерина (ОТХ) из клетокпериферических тканей к печени, в котором ЛПВП играют важную роль, являетсяодним из основных механизмов, обуславливающих антиатерогенные свойстваЛПВП.

Нагруженные холестерином макрофаги (так называемые «пенистыеклетки») являются клеточными маркерами атеросклеротических повреждений.8Транспорт холестерина из макрофагов интимы может защищать сердечнососудистую систему от дальнейшего развития атеросклероза. Таким образом,активация ОТХ может быть эффективной терапевтической стратегией уменьшенияриска развития атеросклероза (Ono, 2012).Одним из ключевых белков ОТХ является АТФ-связывающий кассетныйтранспортер A1 (ABCA1), который осуществляет перенос холестерина нааполипопротеин АI (апо АI).

Нарушения функционирования белка АВСА1 илиснижение экспрессии гена АВСА1 приводят к ускоренному темпу атерогенеза ираннему развитию атеросклероза (Oram, Heineckel, 2005). Дефицит ABCA1 вмакрофагах сопровождается повышенным уровнем холестерина в мембране,увеличением его отложения на артериальной стенке и усилением образованиялипидных пятен (Choi et al., 2009; Francone et al., 2005; Yvan-Charvet et al., 2008).Это свидетельствует о том, что ABCA1 может принимать активное участие вудалении холестерина из атеросклеротических бляшек, а уровень экспрессии егогена может влиять как на начало атеросклеротического процесса, так и настабильность уже существующих атероматозных бляшек. Таким образом,корреляция между содержанием мРНК ABCA1 в макрофагах и уровнемхолестерина в составе ЛПВП также может отражать развитие атеросклероза.В понимании механизмов развития атеросклероза важное значение имеетсемейство ядерных рецепторов, которые регулируют липидный гомеостаз и ОТХ,усиливают экспрессию генов аполипопротеина Е (апо Е) и генов транспортеровABCA1 и АТФ-связывающего кассетного транспортера G1 (ABCG1) (Bensinger etal., 2008; Oosterveer et al., 2010).