Диссертация (Экспрессия генов транскрипционных факторов LXRalpha, LXRbeta, PPARgamma и транспортера ABCA1 при атеросклерозе), страница 10

Равные количества белка макрофагальныхлизатов смешивали с 4х буфером Лаемли (200мМ Tris-HCl pH 6,8, 400 мМ βмеркаптоэтанол, 4 % додецилсульфат, 0,01 % бромфенол, 40 % гицерол (Laemmliet al., 1970) в соотношении 2 объема белка/1 объем буфера, после чего кипятили втечение 5 мин. при температуре 1000С. После кипячения пробы (5мкг на лунку), атакже маркер молекулярного веса (Thermo Fisher Scientific, США), наносились наполиакриламидный гель (SDS-PAGE) с последующим проведением электрофорезав 1Х трисглициновом буфере (5Х стоковый раствор содержит: 25мM Tris-HCl pH8,8, 250 мM глицина (pH 8,3), 0,1 % додецилсульфата). После этого сиспользованием прибора для полусухого переноса Semi-dry (Хеликон, Москва)проводился перенос белка с полиакриламидного геля наPVDF мембрану(Millipore, Massachusetts, США) с использованием буфера для переноса (39 mMглицина, 48 мМ Tris-HCl pH 8,8, 0,037 % додецилсульфата, 20 % метанола).

Далеесогласно молекулярному весу белка ABCA1 и β-актина мембрану разрезали иполученные фрагменты однократно промывали в растворе PBS, после чегопроизводили их «забивку» 5% разведенным в растворе PBS обезжиренным сухиммолоком в течение 1 часа при комнатной температуре. После «забивки» фрагментPVDF мембраны, содержащий ABCA1, инкубировали с первичными кроличьимиполиклональными антителами к ABCA1 (1:1000; ab7360, Abcam, Великобритания),а фрагмент PVDF мембраны, содержащий β-актин, с антителами к ß-актину(1:10000; ab8227, Abcam, Великобритания) в течение ночи при +4 0С. После этоготрижды промывали в холодном растворе PBS фрагменты мембраны иинкубировали их в течение 1 часа при комнатной температуре со вторичными63антикроличьими антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (1:3000;ab6721, Abcam, Великобритания).

Затем снова трижды промывали холодным PBS.Далее связанные с соответствующим белком на обоих фрагментах мембранывторичные антитела идентифицировали с использованием набора Amersham ECLPlusSystem(AmershamBiosciences,Великобритания)сиспользованиемфотопленки CEA (Швеция).Данные вестерн-блоттинга анализировали с помощью программы ImageJ(Версия 1.38a для Windows, http://rsb.info.nih.gov/ij/).

Содержание ABCA1нормировали к содержанию ß-актина.2.6 Статистическая обработка данных.Статистический анализ данных был проведен с использованием пакетапрограмм Statistica 6.0. Для качественных данных определяли частотывстречаемости в %. Проверку соответствия полученного распределения генотиповравновесию Харди-Вайнберга осуществляли при помощи непараметрическогокритерия χ2. Соответствие полученных данных нормальному распределениюпроверялось с помощью критериев Шапиро-Уилка или Колмогорова-Смирнова взависимости от размера выборки. Для сравнения количественных данныхиспользовали метод дисперсионного анализа ANOVA для нескольких групп инепараметрический метод U-теста Манна-Уитни.

Значения p<0.05 считалисьстатистически значимыми. Для определения относительного риска использовалипоказатель соотношения шансов (odds ratio, OR), рассчитываемый по формулеOR=××где a – количество пациентов, имеющих более редкую аллель, b – количествопациентов, не имеющих более редкую аллель, c – количество индивидуумов изконтрольной группы, имеющих более редкую аллель, d – количествоиндивидуумов из контрольной группы, не имеющих более редкую аллель.

Дляопределения корреляции между количественными характеристиками пользовалиськорреляционным анализом по Спирмену. Коэффициент корреляции r>0.5 при64р<0.05 означал положительную и статистически значимую корреляцию междупризнаками, а отрицательное значение r соответствовало обратной корреляции.Средние величины в тексте диссертации и в таблицах приведены в видесреднего значения ± стандартное отклонение.

В случае достоверных различийдополнительно приведены значения медианы (минимум – максимум).65Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕОбщая характеристика группы больных с атеросклерозом, подтвержденными представителей контрольной группы, приведена в таблице 3.Таблица 3Характеристика группы пациентов с атеросклерозом, подтвержденнымметодом ангиографии, и контрольной группыПараметрВозраст (лет)ВозрастпервыхклиническихГруппа пациентов сКонтрольнаяатеросклерозомгруппа(N=119)(N=300)51.41±6.2145.60±6.3047.87±7.05манифестаций (лет)Пол (%мужчин/%женщин)79/2163/37Курение (%)57.14*43.53ОХС, ммоль/л5.82±0.535.44±0.39Х-ЛПВП, ммоль/л0.93±0.11*1.17±0.09Сокращения:ОХС–общийхолестерин,Х-ЛПВП–холестеринлипопротеинов высокой плотности.Примечание: Данные представлены в виде M±SD, где M – среднее значение,SD – стандартное отклонение; N – объем выборки; *p<0.05.В таблице 3 представлены средние значения основных показателейлипидного обмена.

Проведенный нами сравнительный анализ содержанияхолестерина и его фракций в сыворотке крови больных и контрольной группы66соответствовал общепринятому определению состояния обмена липидов согласнорекомендациямВсероссийскогонаучногообществакардиологов(ВНОК)(Рекомендации ВНОК, 2009).У большинства пациентов с атеросклерозом отмечены традиционныефакторы риска развития заболевания – курение и пониженный уровень Х-ЛПВП.Данные показатели достоверно отличались от показателей лиц контрольнойгруппы (p<0.05).

Таким образом, подтверждается вклад в риск развитияатеросклероза таких факторов, как курение и снижение уровня антиатерогенногоХ-ЛПВП.В изучение молекулярных механизмов атеросклероза артерий особоевнимание уделяется исследованиям экспрессии генов липидного обмена вмакрофагах артериальной стенки, представляющих собой основной тип клеток,участвующих в образовании очагов поражения при атеросклерозе.Для оценки уровня мРНК генов PPARγ, LXRα, LXRβ, MMP-9 и ABCА1 иуровня белка ABCА1 в макрофагах, активированных M-CSF, были сформированыгруппа пациентов и контрольная группа. Общая характеристика группы больныхатеросклерозом, подтвержденным ангиографическим методом, и контрольнойгруппы, приведена в таблице 4.Поскольку мужской пол является фактором риска развития атеросклероза иССЗ нами была подобрана группа больных мужского пола (15 человек, 53.87+6.78лет) и контрольная группа, состоящая из 19 человек (52.05±6.05) также мужскогопола.Курение является одним из традиционных факторов риска развитияатеросклероза.

В таблице 4 представлены частоты курящих индивидуумов висследуемых группах. По данному показателю не было отмечено достоверныхразличий между исследуемыми группами.67Таблица 4Характеристика группы пациентов с атеросклерозом и контрольной группы,отобранных для изучения уровня мРНК генов PPARγ, LXRα, LXRβ, MMP-9 и ABCА1и уровня белка ABCА1 в макрофагах.ПараметрВозраст (лет)ВозрастпервыхклиническихГруппа пациентов сКонтрольнаяатеросклерозомгруппа(N=15)(N=19)53.87±6.7852.05±6.0547.73±4.33манифестаций (лет)Пол (%мужчин/%женщин)100/0100/0Курение (%)33.3331.58ОХС, ммоль/л4.75±1.174.84±1.11Х-ЛПВП, ммоль/л1.15±0.26*1.39±0.30Сокращения:ОХС–общийхолестерин,Х-ЛПВП–холестеринлипопротеинов высокой плотности.Примечание: Данные представлены в виде M±SD, где M – среднее значение,SD – стандартное отклонение; N – объем выборки; *p <0.05.При парном сравнении двух выборок – независимой группы здоровыхиндивидуумов и пациентов с атеросклерозом, выявлены статистически значимыеразличия в уровне Х-ЛПВП.

Средний уровень Х-ЛПВП был ниже в группе68больных, чем в контрольной группе (p<0.05). Однако средние уровни ОХС в плазмекрови не различались между исследуемыми группами.Современные клинические рекомендации рассматривают Х-ЛПВП как одиниз важнейших факторов кардиоваскулярного риска, мониторинг которогонеобходим для оценки качества гиполипидемических мероприятий (AdultTreatment Panel III of the National Cholesterol Education Programme, 2002). Внастоящее время снижение уровня Х-ЛПВП в плазме крови ассоциируется сповышением уровня Х-ЛПНП и Х-ЛПОНП в эндотелии артерий, нарушением ихтранспорта в гепатоциты, активацией продукции провоспалительных цитокинов,локальнымобразованиемпенистыхклеток,формированиемдисфункцииэндотелия. Показано, что все эти процессы влияют и на величины риска развитияатеросклероза.

При проведении гиполипидемических мероприятий наибольшаяроль отводится статинам, которые снижают образование холестерина и ЛПНП,увеличивают соотношение ЛПВП/ЛПНП. снижают включение холестерина всубинтиму сосудов. Однако было показано, что статины также могут снижатьэкспрессию гена ABCA1 в моноцитах и макрофагах у человека (Wong et al., 2008).Поэтому, нами были отобраны пациенты с атеросклерозом, которые не получалистатинов либо других гиполиподемических препаратов, для исключениявозможного изменения экспрессии исследуемых генов и уровень липопротеинов вплазме крови под влиянием данных препаратов.Задачей нашего исследования было изучение экспрессии генов PPARγ, LXRα,LXRβ, MMP-9 и ABCА1 в макрофагах, активированных фактором M-CSF.

Выборэтих параметров был продиктован тем, что они в значительной мере определяютхарактеристику липидного обмена в макрофагах и механизмы развитияатеросклероза.Ранее было показано, что фактор M-CSF действует на моноциты in vivo,стимулируяихдифференцировкувмакрофаги.Данныемакрофагихарактеризуются проатерогенным фенотипом, и именно этот подкласс макрофаговпреимущественно присутствует в атеросклеротических бляшках (Di Gregoli,69Johnston, 2012). Экспрессия M-CSF повышена в атеросклеротических бляшкахчеловека и животных (Clinton et al., 1992). Таким образом, инкубированиемоноцитов в течение 5 суток в присутствии M-CSF позволяет получить макрофагии исследовать экспрессию генов PPARγ, LXRα, LXRβ, MMP-9 и ABCА1 в условиях,приближенных к условиям in vivo.Микрофотографии моноцитов и макрофагов представлены на Рисунок 13.Популяциямоноцитовхарактеризоваласьзначительнымчисломклетоксферической и овальной формы, имеющих округлое темное ядро, а макрофагибыли представлены крупными клетками с выраженной адгезией на стекле изначительным присутствием полигональных клеток с множеством псевдоподий.Рисунок13.Дифференцировкамоноцитов,культивированныхвприсутствии М-CSF, в макрофаги.

а - Моноциты, культивированные 2 часа; б Макрофаги после 5 суток культивирования в присутствии M-CSF.3.2 Анализ вклада вариантов гена АВСА1 (R219K, 319ins<G, (-17)G>C) вразвитие атеросклерозаЧастоты вариантов гена АВСА1 (R219K (G655A), 319ins<G, (-17)G>C) вгруппе больных с атеросклерозом и в контрольной группе представлены в таблице705.

В исследуемых группах распределение генотипов гена ABCA1 находилось всоответствии с распределением Харди-Вайнберга.Таблица 5Частоты вариантов гена АВСА1 в группе пациентов с атеросклерозом, и вконтрольной группеВарианты гена АВСА1Группа пациентовКонтрольнаяс атеросклерозомгруппа ЧастотаЧастота аллелейаллелейn (%)n (%)RR60(50.4)150(50.0)RK52(43.7)131(43.7)KK7(5.9)19(6.3)f(R аллель)0.720.72f(К аллель)0.280.28CC68(57.1)156(52.0)CG44(37.0)131(43.7)GG7(5.9)13(4.3)f(G аллель)0.760.74f(С аллель)0.240.26NN101(84.9)224(74.6)NG+GG18(15.1)*75+1(25.4)f(N аллель)0.930.87f(Gаллель)0.070.13R219K(-17)G>CInsG319*p<0.05, OR (NG+GG vs NN) = 0.55, (95%ДИ: 0.35-0.86)В нашем исследовании показано, что в контрольной группе, которуюсоставили представители Санкт-Петербурга, частоты вариантов гена АВСА1(R219K, 319ins<G, (-17)G>C) были сопоставимы со значениями, полученными вевропейских популяциях (Zwarts et al., 2002; Jensen et al., 2007; Ma et al., 2011).71Различий в частотах вариантов R219K и (-17)G>C гена АВСА1 междугруппой пациентов с атеросклерозом и контрольной группой не было обнаружено(Таблица 5).В группе пациентов с атеросклерозом наблюдалось достоверное снижениечастоты варианта G319 гена АВСА1 по сравнению с контрольной группой (15.1% и25.4%, соответственно, р=0.03, df=1).