Диссертация (Компьютерное моделирование адсорбции ДНК на липидный бислой, состоящий из молекул фосфатидилхолина), страница 7

Было рассмотренотри начальных расстояния 0.18, 0.5 и 1 нм. Для каждого расстояния было проведеномолекулярно-динамическое моделирование системы в водном растворе.Стандартная система “ДНК-мембрана” состояла из молекулы ДНК (двойнойдодекамер Дрю-Диккерсона (24 пары оснований с общим зарядом -46e), 46 противоионов натрия Na+ , липидной мембраны, состоящей из 288 молекул ПОФХ, и ~ 25000 молекул воды. Общее количество атомов в системе было равно ~ 115 000.Начальная структура двойного додекамера Дрю-Диккерсона в канонической Bформе была получена при помощи программы X3DNA [98].Предварительно для каждого компонента системы (ДНК и липидный бислой)было проведено моделирование с целью начального уравновешивания и валидациисилового поля. Время моделирования систем составило 100 - 150 нс.

Этого временибыло достаточно, чтобы сделать заключение об отсутствии адсорбции ДНК. На Рисунке 4 показано расстояние между молекулой ДНК и липидным бислоем для всехтрех систем.37Рис 4. Временная зависимость расстояния между центрами масс фрагмента ДНК ифосфолипидной мембраны вдоль вектора нормали к поверхности мембраны.Согласно графику в начале моделирования расстояние между ДНК и бислоемувеличивается. Со временем расстояние остается неизменным из-за размеров ячейкимоделирования. Таким образом, можно сделать вывод, что ДНК не адсорбирует налипидный бислой во всех исследуемых системах.Несмотря на то, что данный эффект подтвержден экспериментальными работами, моделирование в обычных условиях не может служить доказательством отсутствия притяжения между ДНК и липидным бислоем, так как охватывает лишь ограниченную область фазового пространства.

Кроме того, недавно было проведенокомпьютерное моделирование системы, в котором анионная наночастица золота ад-38сорбировала на поверхность цвиттерионной фосфолипидной мембраны за счет взаимодействий между отрицательно заряженными лигандами на поверхности наночастицы и положительно заряженными холиновыми группами ФХ липидов [120].

Таккак ДНК также является анионной, следует ожидать, что она также может взаимодействовать с холиновыми группами липидов.Для более убедительного доказательства присутствия или отсутствия притяжения между ДНК и липидным бислоем, был исследован профиль свободной энергии (ПСЭ). С этой целью был применен метод зонтичной выборки, описанный впредыдущей главе.

Система состояла из додекамера ДНК и липидного бислоя, состоящего из 128 липидов. Бислой был уравновешен в течение 250 нс, конечная конфигурация была использована для метода зонтичной выборки. На Рисунке 5 изображен профиль свободной энергии. Координата Z соответствует расстоянию междуцентрами масс липидного бислоя и ДНК. При приближении заряженного объекта,такого как ДНК, к гидрофобной области бислоя следует ожидать резкого увеличениясвободной энергии. Действительно, Рисунок 5 показывает энергетический барьерприблизительно в 130 кДж/моль в области фосфатных групп липидов.

Нетривиальной частью профиля энергий является область справа от среднего положения фосфатных групп липидов. Виден постепенный рост энергетического барьера междуДНК и липидным бислоем при движении ДНК из водной среды к поверхности липидного бислоя. Отсутствие какого-либо локального минимума и отрицательныхэнергий в профиле свободной энергии свидетельствует об отсутствии притяжениямежду ДНК и липидным бислоем. Другими словами, цвиттерионный фосфолипидный бислой представляет собой энергетический барьер для молекулы ДНК.39а)б)Рис. 5. (а) Профиль свободной энергии (ПСЭ) при перемещении молекулы ДНКиз водного окружения к поверхности липидного бислоя.

Вертикальная пунктирная линия соответствует среднему положению фосфатных групп липидов. Статистические ошибки были оценены при помощи бутстреппинг анализа (bootstrapping [117]). (б) Профили плотности показаны для ПОФХ липидов, воды, фосфатных групп липидов (Pфх). Центр бислоя находится в Z = 0 нм.40ГЛАВА 4. Взаимодействие ДНК с липидным бислоем ПОФХ в присутствииионов кальцияКак было уже сказано в первой главе, одним из способов вызватьвзаимодействие между ДНК и цвиттерионными липидами является добавлениедвухвалентных катионов.

Настоящая глава посвящена изучению адсорбции ДНК налипидный бислой в присутствии ионов кальция и детальному исследованиюмеханизма образования ДНК-липидного комплекса на атомистическом уровне. Главадля удобства разделена на несколько разделов, отвечающих разным способам иметодам исследования систем.

Первая часть посвящена исследованию адсорбциидвухвалентных ионов кальция на фосфолипидный бислой и влиянию катионов наструктурные свойства бислоя. Следующей задачей было исследовать энергетическийпрофиль системы “ДНК-липидный бислой с адсорбированным кальцием” припомощи метода зонтичной выборки. Третий раздел посвящен детальному изучениюмеханизма образования ДНК-липидного комплекса в присутствии ионов кальция врастворе. В четвертом разделе представлена кинетика адсорбции фрагмента ДНК налипидный бислой с заранее адсорбированным кальцием, проведен анализструктурных и динамических свойств получившегося комплекса.4.1. Липидный бислой ПОФХ - Ca2+Один из способов прикрепить отрицательно заряженную ДНК к цвиттерионномулипидному бислою — адсорбировать ионы кальция на липидный бислой. Для изучения адсорбции двухвалентных ионов на бислой ПОФХ и их влияния на свойства липидной мембраны, бислой ПОФХ был предварительно уравновешен в течение 200 нсв водном растворе (система 1, Таблица 1).41Таблица 1.

Система ДНК-липидный бислой№Липид/Ca2+СистемасистемыВремя (нс)отношение1ПОФХ288-2002ПОФХ288-Ca0113.14003ПОФХ288-Ca026.44004ПОФХ128-Ca026.44005ДНК-ПОФХ-Ca01-A13.110006ДНК-ПОФХ-Ca01-Б13.110007ДНК-ПОФХ-Ca02-A6.46008ДНК-ПОФХ-Ca02-Б6.41200Затем к уравновешенной конечной конфигурации бислоя были добавлены ионы кальция в отношении липид/кальций 13.1 и 6.4 (система 2 и 3, Таблица 1). Система 3 отличается от системы 4 только размером бислоя (288 и 128 липидов), всеструктурные и динамические характеристики для этих систем совпадают.

На Рисунке6 процесс адсорбции ионов кальция на поверхность бислоя показан через изменениеколичества контактов между ионами кальция и фосфатными группами липидов монослоя в зависимости от времени моделирования. Можно видеть, что система приходит в равновесие после 200 нс для обеих концентраций кальция (количество контактов между кальцием и фосфатными группами липидов достигает равновесного значения). Как известно, адсорбция ионов кальция изменяет структурные свойства водно-липидной фазы.

Так как ион кальция связывается с фосфатными группами нескольких липидных молекул, можно обнаружить образование ион-липидных агрегатов различного типа.42Рис. 6. Количество контактов между Ca2+ и фосфатными группами липидов в зависимости от времени. Показаны результаты для систем 2 (черный) и 3 (серый).На Рисунке 7 показано количество Ca2+-липид агрегатов различных типов как функция времени. Большинство агрегатов состоит из иона кальция и 3 липидов, однакокомплексы Ca - 4 Pфх также обнаружены. Можно сказать о динамической структурной реорганизации липидов в образовании агрегатов различного типа.43Рис. 7. Количество различных типов Ca2+-липидных агрегатов как функциявремени (приведены данные для монослоя системы 2).

Вышеприведенныезначения были усреднены по последним 100 нс МД траекторий.Среднее количество ФХ липидов на один ион кальция равно 3,2 ± 0.2 (усреднениепроведено по последним 100 нс траектории моделирования системы 3 и над обоимимонослоями). Ионы кальция, которые связаны с мембраной за счет образования липидных агрегатов, приводят к уменьшению площади, приходящейся на один липид.Эта площадь равна 0.63 ± 0.01 нм2 и 0.62 ± 0.01 нм2 для систем 3 и 4, соответственно.В то же время липидный бислой без кальция имеет площадь 0.65 ± 0.01 нм2 (система1, Таблица 1). Кроме того, формирование агрегата Са-липид приводит к сближению44фосфатных групп, выталкивая холиновые группы в водную фазу, что приводит к более вертикальной ориентации головных групп липидов. Так, для липидного бислоя вотсутствии кальция средний угол между липидным вектором PN и вектором нормали к поверхности мембраны, равен 69.3 ± 1.4 градусов.

При добавлении Ca2+ ионовэтот угол уменьшается до 62.8 ± 1.5 и 58.6 ± 1.6 градусов для систем 2 и 3, соответственно.Все изменения в структуре бислоя ПОФХ, вызванные адсорбцией кальция хорошо согласуются с ранее проведенным компьютерным моделированием [121].Важно подчеркнуть, что в конце моделирования все ионы кальция связаны с липидной поверхностью, так что водный раствор не содержит свободных ионов. Такимобразом, в конце моделирования липидный бислой имеет 22 и 45 адсорбированныхионов кальция для системы 3 и 4, соответственно. Это означает, что бислои имеютположительный заряд +44е и +90е (системы 2 и 3,соответственно). Таким образом,при добавлении ионов кальция цвиттерионный липидный бислой становится положительно заряженным.