Диссертация (Компьютерное моделирование адсорбции ДНК на липидный бислой, состоящий из молекул фосфатидилхолина)

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждениевысшего образования«САНКТ- ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»На правах рукописиАНТИПИНА Александра ЮрьевнаКОМПЬЮТЕРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ АДСОРБЦИИ ДНК НА ЛИПИДНЫЙБИСЛОЙ, СОСТОЯЩИЙ ИЗ МОЛЕКУЛ ФОСФАТИДИЛХОЛИНАСпециальность 02.00.06 – Высокомолекулярные соединенияДиссертация на соискание ученой степеникандидата физико-математических наукНаучный руководительдоктор физико–математических наукГуртовенко А.А.Санкт-Петербург20162ОглавлениеВВЕДЕНИЕ .............................................................................................................................................. 3ГЛАВА 1.

Литературный обзор ............................................................................................................ 101.1. Векторы доставки генетического материала ........................................................................... 101.2. Векторы доставки на основе липосом...................................................................................... 121.3.

Экспериментальные исследования цвиттерионных липидов и молекул ДНК ..................... 141.4. Компьютерное моделирование ДНК и липидного бислоя. .................................................... 22ГЛАВА 2. Используемые методы и подходы ...................................................................................... 28ГЛАВА 3. Взаимодействие ДНК с липидным бислоем ПОФХ ........................................................ 36ГЛАВА 4.

Взаимодействие ДНК с липидным бислоем ПОФХ в присутствии ионов кальция. .... 404.1. Липидный бислой ПОФХ - Ca2+ ............................................................................................... 404.2. ДНК-липидный комплекс. Энергия связывания комплекса. .................................................. 444.3. Молекулярный механизм образования ДНК-липидного комплекса в присутствии ионовкальция. .............................................................................................................................................. 474.4.

Связывание ДНК с бислоем с пред-адсорбированными ионами кальция ............................ 65ЗАКЛЮЧЕНИЕ ..................................................................................................................................... 71СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ..................................................................................................................... 723ВВЕДЕНИЕАктуальность темы исследованияИсследование взаимодействий молекул ДНК с цвиттерионными липиднымимембранами является важной задачей как с точки зрения практического примененияДНК-липидных комплексов в генной терапии, ДНК-нанотехнологиях, так и дляболее глубокого понимания биологических процессов, происходящих внутри клетки.В последние 15-20 лет наблюдается большой интерес к использованиюсинтетических невирусных средств доставки ДНК (генных векторов) [1-8].

МолекулаДНК является полианионом и, следовательно, способна образовывать стабильныекомплексы с положительно заряженными (катионными) молекулами за счетэлектростатических взаимодействий. Одним из наиболее изученных классов такихмолекул являются катионные липиды [9-11]. Однако клеточные мембраны несодержат в своём составе катионные липиды, только цвиттерионные (нейтральные) ианионные липиды. Поэтому генные векторы на основе катионных липидов являютсядостаточно токсичными для клеток и организма в целом, и в настоящее времяведутся исследования по возможной замене катионных липидов на цвиттерионныелипиды, входящие в состав клеточных мембран и, следовательно, не обладающиетоксичностью для организма. В частности, экспериментально было показано, чтонейтральные (цвиттерионные) липиды в присутствии двухвалентных ионов металловведут себя подобно катионным [12]. Таким образом, одним из возможныхбезопасных средств доставки ДНК в клетку могут быть векторы на основецвиттерионных липидов (вместо токсичных катионных липосом).Помимо использования цвиттерионных липосом в качестве векторов доставкиДНК в клетки исследование взаимодействий ДНК с липидами (в том числе и с цвит-4терионными) представляет интерес также и с точки зрения бионанотехнологическихприменений [13].

Для исследования сложных клеточных механизмов и межклеточных взаимодействий часто используют модельные липидные везикулы и комплементарные свойства ДНК для создания гибридных систем. Взаимодействие с биосистемами наноструктур на основе ДНК неизбежно включает в себя взаимодействие ДНКс липидным бислоем клеточной мембраны, что подчеркивает важность ДНКлипидных взаимодействий для понимания влияния наноматериалов на клеточнуюповерхность.В целом, несмотря на большое значение, которое играют ДНК-липидныевзаимодействия, точный молекулярный механизм адсорбции ДНК на цвиттерионнуюмембранувприсутствиидвухвалентныхионовидетальнаяструктураполучившегося ДНК-липидного комплекса остаются малоизученными.

Более того,детальная микроскопическая структура комплекса “ДНК-цвиттерионные липиды”является труднодоступной для экспериментальных методик, а существующиенемногочисленные теоретические работы не описывают полную картину процессакомплексообразования [14, 15].Таким образом, несмотря на большой интерес с точки зрения генной терапии,медицины и биотехнологий, микроскопические механизмы, лежащие в основеобразования ДНК-липидных комплексов, являются на данный момент все ещемалоизученными, что говорит о безусловной актуальности данной работы.Цель работы:Исследование механизма адсорбции ДНК на цвиттерионные липидные мембраны,состоящиеизмолекулмолекулярно-динамическогофосфотидилхолина,компьютерногоспомощьюатомистическогомоделирования.Изучениевзаимодействий молекул ДНК с липидными молекулами фосфатидилхолина намикроскопическом уровне и детальный анализ структуры получившихся комплексов.5Задачи исследованияВ рамках данной работы были поставлены следующие задачи:1.

Получение профиля свободной энергии для систем “ДНК-липидный бислой” и“ДНК-липидный бислой с пред-адсорбированными ионами кальция”.2. Проведение компьютерного моделирования адсорбции ДНК на поверхностьцвиттерионного липидного бислоя в присутствии ионов кальция. Изучениеструктурных и динамических характеристик образовавшегося комплекса "ДНК –липидный бислой". Установление молекулярного механизма, лежащего в основеобразования комплекса.Методология и методы исследованияДля достижения поставленных задач было применено компьютерное моделированиеметодом молекулярной динамики с использованием вычислительных ресурсовсуперкомпьютера МГУ “Ломоносов” и компьютерного кластера ИВС РАН.Научная новизна работы1.

Впервые было проведено атомистическое молекулярно-динамическое моделирование системы ДНК-цвиттерионный липидный бислой, состоящий из молекулфосфатидилхолина (ФХ). В работе были использованы современные модели атомистического разрешения для ДНК (AMBERparmbsc0 [16]) и фосфолипидов(AMBER Lipid14 [17]).2. Впервые был рассчитан профиль свободной энергии для системы “ДНК - цвиттерионный липидный бислой” методом молекулярной динамики с использованиеммоделей атомистического разрешения. Получен потенциальный барьер для взаимодействия ДНК с липидным цвиттерионным бислоем, указывающий на отсутствие взаимодействий ДНК с ФХ бислоем в водном растворе. В то же время показано, что ионы кальция, адсорбированные на поверхность фосфолипидногобислоя, способствуют адсорбции ДНК на бислой.63.

Впервые в работе показано, что ионы кальция играют ключевую роль в стабилизации ДНК-липидного комплекса посредством связывания фосфатных групп ДНКи липидных молекул. В противовес существующим гипотезам результаты исследования показали, что взаимодействия между холиновыми группами фосфолипидов и фосфатными группами ДНК несущественны для стабилизации комплекса.Практическая значимость работыИсследованиевзаимодействийДНКсцвиттерионнымифосфолипиднымимолекулами представляет значительный интерес с точки зрения создания генныхвекторов доставки на основе липосом. К настоящему моменту экспериментальноустановлено, что ДНК может образовывать с фосфолипидами стабильные комплексыв присутствии двухвалентных ионов, однако молекулярный механизм, лежащий воснове образования комплексов, оставался неизвестным. Для исследования этогомеханизма в данной работе было использовано атомистическое молекулярнодинамическое компьютерное моделирование.

Такой подход позволил детальноизучить кинетику адсорбции ДНК на цвиттерионную фосфатидилхолиновуюмембрану в присутствии ионов кальция, также структуру и стабильностьобразовавшегося комплекса. Установленный в работе механизм образованиястабильного ДНК-липидного комплекса в присутствии ионов кальция может бытьиспользован для оптимизации существующих генных векторов на основе липосом.Результаты данной работы важны также для более глубокого пониманиямолекулярных механизмов, лежащих в основе нековалентных взаимодействий ДНКи наноструктур на основе ДНК с поверхностями сложной структуры, такими какклеточные мембраны.На защиту выносятся следующие положения:1. Цвиттерионный фосфолипидный бислой представляет собой энергетическийбарьер для молекулы ДНК.