Диссертация (Компьютерное моделирование адсорбции ДНК на липидный бислой, состоящий из молекул фосфатидилхолина), страница 8

В следующем разделе будет продемонстрировано, что этотположительный заряд вызывает адсорбцию ДНК на липидную поверхность.4.2.ДНК-липидный комплекс. Энергия связывания комплексаС целью изучения влияния ионов кальция на взаимодействия между молекулой ДНК и цвиттерионным липидным бислоем был использован метод зонтичнойвыборки для бислоя с заранее адсорбированным кальцием (система 4, Таблица 1).Чтобы уменьшить время вычислений, был использован липидный бислой с таким желипид/кальций отношением, как в системе 3, но меньшим по размеру и состоящимиз 128 липидов.

В конце траектории липидный бислой имел общий положительныйзаряд +40e (20 Ca2+ адсорбированных ионов). На Рисунке 8(а) представлен профильсвободной энергии для молекулы ДНК при приближении её к липидному бислою сзаранее адсорбированным кальцием. При сравнении ПСЭ для системы без кальция,45описанного в предыдущей главе (Рис. 5), и Рисунка 8 (а) можно сделать следующийвывод: адсорбированные ионы кальция на поверхность бислоя приводят к возникновению минимума в профиле свободной энергии. Этот минимум характеризуется отрицательными энергиями и соответствует электростатическому притяжению междумолекулой ДНК и липидным бислоем. Минимальное значение энергии в Z = 3 нм, тоесть приблизительно на расстоянии 1 нм от среднего положения фосфатных групплипидов и адсорбированных ионов кальция (стоит напомнить, что Z – это расстояние между центрами масс ДНК и липидного бислоя).

Как известно, диаметр ДНКканонической B-формы равен 2 нм. Следовательно, основываясь на Рисунке 8,наиболее энергетически выгодное положение ДНК в водно - липидной фазе располагается там, где отрицательно заряженные фосфатные группы ДНК находятся в контакте с адсорбированными на липидную поверхность ионами кальция. Кроме того,адсорбированные ионы кальция уменьшают энергетический барьер для проникновения ДНК до среднего положения фосфатных групп липидов до 45 кДж/Моль (Рис.

7)по сравнению с 130 кДж/Моль для системы без кальция (Рис. 5). Глубина обнаруженного энергетического минимума равна приблизительно -80 кДж/Моль. Такая величина является достаточно большой и объясняется большим количеством адсорбированных ионов кальция на липидный бислой (один ион кальция на 6,4 липида).46а)б)Рис. 8. (а) Профиль свободной энергии (ПСЭ) при перемещении молекулы ДНКиз водного окружения к поверхности липидного бислоя с адсорбированнымиионами кальция. Вертикальная пунктирная линия соответствует среднему положению фосфатных групп липидов. Статистические ошибки были оценены припомощи бутстреппинг анализа (bootstrapping [117]). (б) Профили плотности дляПОФХ липидов, воды, фосфатных групп липидов и ионов Ca2+.

Для наглядностиплотность ионов кальция показана увеличенной в 5 раз.47Такое количество ионов значительно превосходит физиологическую концентрациюи было выбрано с целью уменьшения времени моделирования. Помимо этого, длянекоторых нанотехнологических приложений концентрация ионов соли может значительно отличаться от биологической. Очевидно, что уменьшение количестваионов кальция в системе будет способствовать уменьшению глубины потенциальнойямы и, соответственно, ослаблению электростатического притяжения между ДНК илипидным бислоем.

В связи с этим, Рисунок 8 должен рассматриваться в основномкак качественный результат. Таким образом, из вышесказанного следует вывод, чтоионы кальция, адсорбированные на поверхность цвиттерионного (нейтрального)фосфолипидного бислоя, способствуют притяжению между ДНК и бислоем.4.3. Молекулярный механизм образования ДНК-липидного комплекса вприсутствии ионов кальцияЧтобыизучитьмеханизмобразованияДНК-липидногокомплексавприсутствии ионов кальция, было проведено компьютерное моделирование, вкотором ДНК располагалась в непосредственной близости от поверхности липидноймембраны.Былирассмотреныразныеначальныеусловия.Сначалабылиисследованы системы, в которых ионы одновременно с ДНК были добавлены враствор с липидным бислоем. В этом случае в начале компьютерного эксперименталипидная мембрана не имела положительного заряда, а отрицательно заряженнаяДНК была окружена двухвалентными ионами кальция.

Образование комплекса вданном случае является сложным процессом, требующим детального рассмотрениянаатомистическомуровне.Дополнительнобылопроведенокомпьютерноемоделирование, в котором ДНК была расположена вблизи липидного бислоя с пред адсорбированными ионами кальция (раздел 4.4).

Были рассмотрены кинетика,динамические и структурные изменения данных комплексов. Таким образом,48следующие два раздела посвящены молекулярному механизму образования ДНКлипидного комплекса.Для изучения адсорбции молекулы ДНК на нейтральный бислой в присутствииионов кальция в растворе были рассмотрены следующие системы (Таблица 2).Таблица 2. Список исследуемых систем.№Система ДНК-мембранасистемыНачальноеВремярасстояние (нм)моделирования(нс)а1ДНК-ПОФХ-Ca-0.180.181502ДНК-ПОФХ-Ca-0.5a0.51503ДНК-ПОФХ-Ca-0.5б0.51504ДНК-ПОФХ-Ca-0.5-NaClв0.51505ДНК-ПОФХ-Ca-0.50.56006ДНК-ПОФХ-Ca-1.01.0600Начальная конфигурация системы отличается от системы ДНК-ПОФХ-Ca-0.5 си-стемы поворотом ДНК на 90º в плоскости мембраны.

б Начальная конфигурация системы отличается от системы ДНК-ПОФХ-Ca-0.5 поворотом ДНК на 90º вокругглавной оси ДНК. в Начальная конфигурация системы отличается от системы ДНКПОФХ-Ca-0.5 присутствием 100 ммоль NaCl.Типичная система “ДНК-липидная мембрана” состояла из фрагмента ДНК(двойной додекамер Дрю-Диккерсона из 24 пар оснований с общим зарядом -46е), 46контрионов Na+ , липидного бислоя, состоящего из 288 молекул ПОФХ липидов и ~25 000 молекул воды.

К каждой системе было добавлено 45 Ca2+ ионов и 90 Cl-49ионов, что соответствует концентрации соли ~ 100 ммоль CaCl2 (концентрация быларассчитана относительно общего количества молекул воды). Общее количество атомов в системе было ~ 115 000. Для оценки влияния соли NaCl дополнительно быларассмотрена система, в которой 45 Na+ и 45 Cl+ ионов были добавлены в систему(Таблица 2,система 4). Начальная структура двойного додекамера Дрю-Диккерсонабыла сгенерирована с помощью программы X3DNA.Как видно из Таблицы 2 время моделирования большинства систем составляет100-150 нс. Предварительно для каждого компонента системы (ДНК и липидныйбислой) было проведено моделирование с целью начального уравновешивания и валидации адаптированного силового поля. Моделирование двух систем (ДНК-ПОФХCa-0.5 и ДНК-ПОФХ-Ca-1.0) было продлено до 600 нс.

Траектории моделированияэтих двух систем были использованы для анализа кинетики адсорбции и структурыДНК-липидного комплекса. Большинство структурных характеристик были получены усреднением по последним 200 нс для данных систем (ДНК-ПОФХ-Ca-0.5 иДНК-ПОФХ-Ca-1.0).Начальное расстояние ДНК от поверхности бислоя варьировалось от 0.18 нмдо 1 нм. На Рисунке 9 показано типичное изменение расстояния между центрамимасс молекулы ДНК и фосфолипидной мембраной вдоль вектора нормали кповерхности мембраны как функция времени.50Рис.

9. Временная зависимость расстояния между центрами масс фрагментаДНК и фосфолипидной мембраны вдоль вектора нормали к поверхностимембраны (результаты для систем 1, 5, 6, Таблица 2)Из Рисунка 9 видно, что присутствие ионов кальция в растворе приводит крезкому уменьшению расстояния между липидной мембраной и ДНК. Стоитнапомнить, что в системах без кальция молекула ДНК не приближалась к бислою(Рис. 4). В результате адсорбции ДНК в присутствии двухвалентных ионов,образуется стабильный ДНК-липидный комплекс (Рис. 10).51а)б)Рис.

10. Мгновенная конфигурация системы “ДНК-мембрана” (а) в отсутствииионов кальция и (б) с ионами кальция. Молекула ДНК показана голубым икрасным, липиды серым, ионы кальция желтым.52Таким образом, проведенное компьютерное моделирование успешно воспроизводитрезультаты экспериментальных исследований [12, 42], в которых показаносвязывание ДНК с ПОФХ бислойной мембраной, а также согласуется с профилемэнергий, описанным в предыдущем разделе (Рис. 8а).

Следовательно, можновоспользоваться данной теоретической моделью высокого разрешения для тогочтобы исследовать кинетику адсорбции на микроскопическом уровне. Как былоранее упомянуто, существует две моды связывания ДНК с ФХ липидами вприсутствии ионов кальция: 1) взаимодействия между холиновой группой липида ифосфатной группой ДНК и 2) связывание фосфатных групп ДНК и липидов черезион кальция [12].

Для определения роли этих двух мод в адсорбции ДНК, былорассчитано количество различных контактов между ДНК, липидами и ионамикальция в зависимости от времени. Данная зависимость изображена на Рисунке 10.Прежде всего видно, что на начальных этапах адсорбции ДНК связывание ионовСа2+ с фосфатными группами ФХ липидов оказывается самым быстрым процессом.Это связывание начинается сразу же после начала моделирования и делаетповерхность мембраны положительно заряженной: монослой мембраны из 144липидов приобретает положительный заряд +30е (15 адсорбированных ионов Ca2+) втечение приблизительно 50 нс (Рис. 11, 12).

Положительный заряд поверхностимембраны вызывает электростатическое притяжение ДНК к поверхности мембраны,что приводит к адсорбции. Об этом свидетельствует резкое увеличение контактовмежду фосфатными группами ДНК и холиновыми группами липидов (Рис. 11).53Рис. 11. Количество контактов между холиновыми группами липидов и ДНК(Nфх-Pднк), количество кальциевых мостиков между фосфатными группами ДНКи липидов (Ca-мостики Pфх-Pднк) и количество контактов ионов кальция сфосфатными группами липидов (Са-Pфх) в зависимости от времени.Отметим, что не все ионы кальция адсорбируют на поверхность мембраны,часть ионов всегда находится в водной фазе, взаимодействуя с ДНК. Интересно, чтопротивоионы Na+ также способствуют первоначальному формированию зарядамембраны, правда, в очень небольшой степени (Рис.