Диссертация (Компьютерное моделирование адсорбции ДНК на липидный бислой, состоящий из молекул фосфатидилхолина), страница 4

Изучение взаимодействия ДНК-липид-катион является сложной и не до конца решенной задачей, в частности, из-за условий проведения эксперимента. Одни методы (в частности, измерение изотерм) зависят от приготовления растворов, pH среды, внешних условий, другие (например, флуоресцентная микроскопия) используют метки, способные влиятьна структуру исследуемых веществ, а третьи (рентгеновский анализ, измерение колебательных спектров) дают информацию только об изменении структуры, о причине данного возмущения можно только выдвигать предположения. Приведем некоторые важные экспериментальные сведения, известные на данный момент.РентгеноструктурныйанализпоказалупорядоченныеструктурыДНК-фосфолипидов, в которых ДНК располагается между бислоями в слоистых структурах различных морфологий [44]. Известно, что фосфолипидные бислои и катионыконденсируют ДНК и она становится менее подвержена температурной денатурации[49]: температура плавления полинуклеотида увеличивается, что говорит о наличиисильного взаимодействия [40].

Работы Викторова с соавторами показали, что взаимодействие ДНК с фосфолипидами приводит не только к иммобилизации молекулыДНК, но и фосфатных групп липидов, а степень связывания ДНК с фосфолипидамизависит от класса фосфолипидов [54]. Кроме того, показано, что ионы кальция посравнению с ионами магния и бария способствуют более сильному взаимодействиюмежду ДНК и липидами [55, 56]. Большие кластеры ДНК-липидных везикул былиобнаружены Айналем с соавторами [42], демонстрирующие связывание ДНК с цвиттерионными липидами, приводящее к плоским областям контакта везикул: ДНК ока-18зывается зажатой между слоями. В этом случае количество многослойных везикулувеличивалось по сравнению с системой, не содержащей ДНК. Недавние экспериментальные работы по исследованию ДНК-ФХ комплекса с ионами магния показали,что ДНК сохраняет свою нативную форму при образовании комплекса, однако приэтом наблюдались локальные структурные изменения в стеккинге оснований и плоскости пар оснований [57], причиной которых могли быть, как полагают авторы, связывание катиона магния с атомом N7 основания ДНК.

В то же время известно, чтомагний предпочтительнее связывается с фосфатом, а не с атомами оснований ДНК.ИК отражательно-абсорбционные спектральные исследования Громельского с соавторами [41] выявили 2’ эндо конформацию дезоксирибозы ДНК, а также показалиувеличение интенсивности симметричного и асимметричного растяжения фосфатных групп при адсорбции ДНК на монослой. Сложно сказать, что вызвало данноеусиление: наличие фосфатных групп ДНК на бислое или изменение ориентациифосфатных групп ФЭ. Жданов с соавторами исследовали спектры 31P-ЯМР для фосфорильных групп полиадениловой и полиуридиловой кислот с липосомами в присутствии магния, которые показали уменьшение химических сдвигов фосфорильныхгрупп нуклеотидов при взаимодействии их с липосомами, наиболее вероятно, с холиновыми группами липидов.

Авторы предположили, что данное уменьшение моглобыть вызвано участием катионов в вышеуказанном взаимодействии за счет образования мостиков между фосфорильными группами липидов и полинуклеотидов [58].Помимо двухвалентных ионов также известны случаи взаимодействия ДНК с цвиттерионными липидами в водно-солевом растворе NaCl, однако, как показали эксперименты, это взаимодействие достаточно слабое [42], а в некоторых случаях вообщене проявляется [41].Экспериментальные работы выдвигают несколько гипотез образования комплекса.

Согласно одной из них, адсорбцию ДНК на липидный бислой могут вызвать19гидрофобные взаимодействия между основаниями ДНК и гидрофобными хвостамилипидов, как в случае с адсорбцией ДНК на полистироловую частицу с отрицательным зарядом [55]. Наиболее же вероятным считается образование комплекса междуфосфатными группами ДНК и гидрофильными головами липидных молекул за счетадсорбции ионов кальция на бислой.

Что касается цвиттерионного липида фосфатидилхолина (Рисунок 1, а), то здесь существует два наиболее вероятных сценария образования комплекса.а)б)PNNPNPРис.1. (а) Схематическое изображение липида фосфатидилхолина. (б). Две схемы образования комплекса. ДНК изображена цилиндром, кальций символом“Ca”, фосфатная и холиновая группы липидов обозначены “P” и “N”, соответственно.

Иллюстрации к Рисункам (а) и (б) взяты из [59] и [12], соответственно.20Согласно первому сценарию ДНК крепится к липидному бислою при помощи кальция, который соединяет фосфатные группы ДНК и липидов. Второй вариант образования комплекса предполагает, что ион кальция проникает между фосфатными группами липидов, что приводит к переориентации головных групп, которые притягиваются к фосфатным группам ДНК (Рисунок 1, б). Несмотря на многочисленные экспериментальные исследования, к настоящему времени точный механизм образованиякомплекса не установлен.Помимо использования цвиттерионных липосом в качестве нетоксичного способа доставки ДНК в клетку, исследование взаимодействия ДНК с липидами (в томчисле и с цвиттерионными) представляет интерес также и с точки зрения бионанотехнологических применений.

Для исследования сложных клеточных механизмов имежклеточных взаимодействий часто используют модельные липидные везикулы испособность ДНК к комплементарности [13, 60]. Такая техника используется, например, при исследовании слияния двух везикул [62 - 63] или изучении влияния внешних факторов на липидную поверхность [64]. В этих случаях ДНК выполняет функцию клеточного белка, связывающего две липидные поверхности, а липидная везикула — роль модельной мембраны, освобожденной от белков и гликализа [65 - 67].Такой подход дает информацию о поведении модельной клеточной поверхности безвлияния мембран-ассоциированных белков.

Благодаря недавним достижениям в области ДНК-нанотехнологии стало возможным конструировать целые гибридные системы, состоящие из ДНК-наноструктур и липидов, способные имитировать функции биологических макромолекул, создавая модельные системы [60, 13]. Наглядными примерами искусственных нанообъектов являются мембранный канал на основеДНК [68], который в перспективе может быть применен в качестве антимикробногоагента, и ДНК-полимеризация на липидной поверхности [69]. В данных системахлипидная мембрана часто служит каркасом для ДНК-оригами. Существует несколько21способов прикрепления ДНК к липидной поверхности. Один из наиболее популярных методов основан на формировании ДНК-конъюгата с гидрофобным “якорем”холестеролом или порфирином [68-70], который вставляется в липидную мембрану.Другой способ прикрепления ДНК к мембране не требует модификаций, а основанна электростатических взаимодействиях.

Как было уже упомянуто выше, в этом случае могут быть применены катионные липиды либо двухвалентная соль.Из всего вышесказанного следует, что ДНК-липидные взаимодействия представляют большой интерес с точки зрения генной терапии, медицины и биотехнологий, однако микроскопические механизмы, лежащие в основе образования ДНКлипидных комплексов остаются малоизученными и труднодоступными для экспериментальных методов. Таким образом, конкретная задача, на решение которойнаправлена данная работа, заключается в изучении комплексов ДНК с цвиттерионными фосфолипидными молекулами, а конкретно, с липидами фосфатидилхолина,одного из основных классов цвиттерионных липидов, входящих в состав клеточныхмембран.

В работе с помощью атомистического молекулярно-динамического компьютерного моделирования исследовано поведение молекулы ДНК вблизи бислоя, состоящего из липидных молекул фосфатидилхолина, и влияние ионов соли на образование и структуру ДНК-липидного комплекса. Такой подход позволил детально изучить процесс взаимодействия молекулы ДНК с липидными молекулами фосфатидилхолина на микроскопическом уровне. Проведенные исследования позволили получить недоступную для существующих экспериментальных методик информацию омеханизмах взаимодействия молекул ДНК с одним из основных липидных компонентов клеточной (плазматической) мембраны, фосфатидилхолином.

В конечномитоге результаты, полученные в рамках данной работы, имеют большое значение дляболее глубокого понимания процессов, связанных с взаимодействиями ДНК с ли-22пидными молекулами, и внесут существенный вклад в создание более эффективныхи безопасных векторов доставки генного материала в клетки.1.4.

Компьютерное моделирование ДНК и липидного бислояМолекула ДНК является подвижной молекулой: она плотно упакована в хромосоме, может временно изгибаться и образовывать петли, связываться с белками, восстанавливать структуру, делиться и удваиваться. Из множества хранящихся в ProteinData Bank (PDB) различных конфигураций молекулы ДНК, полученных при помощирентгеноструктурного анализа и ЯМР, вытекает, что молекула ДНК не имеет жесткойструктуры, как предполагалось изначально, а является гибким полимером.

Свойствогибкости является важным для понимания широкого диапазона конформаций, которые может принимать молекула в разных физиологических условиях. Несмотря нато, что современные экспериментальные методы имеют высокую разрешающуюспособность и могут определять структуру нуклеиновых кислот, зачастую данныеметоды зависимы от условий и не способны дать полное описание динамическихсвойств, в особенности сложных систем.В последнее время появилось большое количество теоретических методов,направленных на воспроизведение свойств как одиночной ДНК, так и в комплексе сбелками [71]. Эти подходы позволяют изучать ДНК на различных уровняхразрешения и предоставляют информацию о структуре, динамике макромолекулы иее взаимодействиях с белками.

Наиболее популярные на сегодняшний день подходыможно сгруппировать в 4 группы в зависимости от уровня разрешения:электронный, атомистический, крупнозернистый и мезоскопический подходы [71].Стоит заметить, что уровень разрешения влияет на методологию моделирования, таккак основные физические модели, лежащие в основе различных подходов,варьируются в зависимости от детализации, начиная от квантово-механическихрасчетов на уровне электронов до мезоскопического представления при изучении23хроматинового волокна.За последние 15-20 лет значительно выросло количество исследований,использующих компьютерное моделирование методом молекулярной динамики(МД) [71-74] для изучения биосистем на молекулярном уровне. В настоящее времяданный метод является одним из наиболее важных инструментов теоретическогоизучения структуры и динамики биологических систем.

Метод молекулярнойдинамики основан на численном решении классических уравнений движениясистемы частиц (атомов), которые взаимодействуют друг с другом посредствомзаданного потенциала взаимодействия (силового поля). Потенциальная энергиявзаимодействия атомов образуется суммированием вкладов внутримолекулярных имежмолекулярных взаимодействий:U  r1 , rN  kb,ij (rij  r0,ij ) 2 ij связанные   4 ij  ij rijij несвязанныеk ,ijk (ijk  0,ijk ) 2 ijk связанные   ij  1 qi q j        rij   ij несвязанные 4 0 rij1261V ,ijkl [1  cos(nijkl  0,ijkl )] ijkl связанные 2(1)Здесь “связанные” описывают взаимодействия между связанными атомами (химические связи и углы), а “несвязанные” описывают кулоновские и Ван-дер-ваальсовывзаимодействия между несвязанными атомами. Полное силовое поле определяетсянабором силовых констант (kb, kθ и Vφ ), равновесными длинами связей и углов (r0, θ0и φ0 ), параметрами Леннарда-Джонса (ε и σ), парциальными зарядами для всех типоватомов.Первые работы по компьютерному моделированию ДНК появились в 1983 году, и время моделирования ограничивалось 100 пс.