Диссертация (Компьютерное моделирование адсорбции ДНК на липидный бислой, состоящий из молекул фосфатидилхолина), страница 9

12). Их связывание довольнонеустойчиво и, вероятно, подавляется адсорбцией Са2+ ионов.54Рис. 12. Количество ионов кальция и натрия, адсорбированных на монослой,находящийся в непосредственной близости к ДНК.Что касается формирования кальциевых мостиков между фосфатнымигруппами ДНК и липидов, то они формируются с задержкой ~ 10-15 нс относительнообразования контактов между холиновыми группами липидов и ДНК. Скорее всего,это связано с тем, что средний угол между вектором PN липида и вектором нормалик поверхности мембраны равен 69,3 ± 1,4 градусов (система 1, Таблица 1), так чтохолиновые группы расположены ближе к водной фазе и более доступны для ДНК вовремя её адсорбции. Примечательно также, что первоначальное образование55кальциевых мостиков между группами Pфх и Pднк происходит гораздо медленнееформирования Nфх-Pднк контактов. Это может быть объяснено тем, что дляобразования кальциевого мостика требуется три группы атомов, а не две, как вслучае контактов Pднк-Nфх.

Что касается противооионов Na+, было замеченонесколько натриевых мостиков с временем жизни менее 600 пс (для ДНК-ПОФХ-Са0,5 системы).В целом, процесс адсорбции ДНК на цвиттерионную ФХ мембрану происходитсравнительно быстро: после добавления ионов Са2+ количество контактов Pднк-Nфхдостигаетсвоегопротивоположностьравновесногоэтомузначенияколичествовтечениекальциевыхпервыхмостиков100нс.Впродолжаетувеличиваться ещё в течение более чем 100-150 нс, это указывает на существованиемедленной структурной перестройки в образующемся ДНК-липидном комплексе.Эти структурные изменения связаны со сложным многоступенчатым образованиемагрегатов ионов кальция и фосфатных групп липидов и ДНК.

Сначала образуетсякальциевый мостик между фосфатом ДНК и фосфатом одного липида ФХ, позднееже в течение нескольких сотен наносекунд большинство агрегатов уже включаютодин фосфат ДНК и фосфаты трёх липидов (Рис. 13).56Рис. 13. Количество агрегатов Pфх-Ca-Pднк различного типа в зависимости отвремени.Наблюдаемый механизм формирования агрегатов напоминает собственныенаблюдения процесса связывания ионов кальция с фосфатидилхолиновой мембраной(Рис. 7) и ранее проводимых экспериментов в отсутствии ДНК [121].Согласносуществующимэкспериментальнымисследованиям,созданиеконтактов между холиновыми группами ФХ липидов и ДНК может быть облегченопутем дополнительной вертикальной переориентации полярной головной группылипидов по отношению к вектору нормали к поверхности мембраны.

Этапереориентация действительно наблюдается в ДНК-липидной системе с ионамикальция: средний угол между вектором PN фосфолипида и вектором нормали к57поверхности мембраны постепенно уменьшается с 69,2 до 60,0 градусов (Рис. 14).Рис. 14. Временная зависимость среднего угла между вектором PN фосфолипида ивектором нормали к поверхности мембраны (черный). Также показан угол длялипидов, холиновые группы которых находятся в непосредственном контакте сфосфатами ДНК (серый)Такое поведение вызвано в основном адсорбцией ионов кальция на мембрану итакже наблюдается в системе, не содержащей ДНК [121] (система 2, Таблица 1). Внашем случае адсорбция ДНК на поверхность мембраны вызывает дополнительную,более вертикальную переориентацию липидов, холиновые группы которых58соприкасаются с фосфатами ДНК на начальной стадии адсорбции, когдабольшинство атомов ДНК по-прежнему находятся в водной фазе (Рис.

9). На болеепоздних стадиях, когда фрагмент ДНК всё глубже и глубже проникает в воднолипидную фазу, ДНК прижимает холиновые группы к мембране, так чтонаблюдаемаядополнительнаяпереориентацияголовнойгруппылипидауменьшается.Вдавливание ДНК в липидный бислой приводит к тому, что холиновые группыобразуют контакты не только с фосфатами ДНК, но также с атомами бороздок ДНК(Рис.

10б). Изучение радиальных функций распределения холиновых групп липидовс различными электроотрицательными атомами оснований ДНК подтвердилоналичие контактов, однако не показало каких-либо предпочтений холиновых группотносительно определенных участков ДНК. Таким образом, наличие контактовмежду холиновыми группами липидов и атомами оснований ДНК, скорее всего,вызвано стерическими ограничениями, связанными с “вдавливанием” ДНК вмембрану.Одна из наиболее важных нерешенных проблем связана с ролью двух типовДНК-липидных взаимодействий в стабильности комплекса. Чтобы исследовать вкладкаждого типа взаимодействий, были рассчитаны времена жизни для обоих типовконтактов.

Время жизни контактов Pднк-Nфх рассчитывалось как среднееколичествовремени,котороеатомфосфораДНКпроводитвпервойкоординационной сфере атома азота холиновой группы липида. В свою очередь,время жизни кальциевого мостика — это время, которое оба атома фосфатных группмолекулы ДНК и липида проводят в первой координационной сфере одного и тогоже иона кальция.Было обнаружено, что время жизни Са-связанных Pфх-Pднк мостиковсоставляет 98 ± 14 нс, а время жизни холин-ДНК фосфатных контактов равно 3,2 ±591,5 нс (усреднение проводилось по последним 200 нс траекторий, когда адсорбцияДНК уже закончена, Рис. 11).

Таким образом, расчеты свидетельствуют о том, чтоСа-связанные Р-Р мостики являются доминирующим фактором в стабилизациикомплекса ДНК-мембрана, так как их время жизни почти на 2 порядка больше, чемсоответствующее время жизни прямых контактов холиновых групп липидов и ДНК.Было обнаружено, что время жизни некоторых кальциевых мостиковпревышает половину микросекунды, что близко к общему времени моделирования.Кроме того, кальциевые мостики являются фактором, приводящим к увеличениювремени жизни контактов Nфх-Pднк.

Детальный анализ самых стабильных контактовNфх-Pднк показал, что большинство стабильных контактов холин-ДНК существуетблагодаря совокупности двух факторов: наличию кальциевого мостика и сильнойадсорбции ДНК на липидную мембрану, что приводит к иммобилизации липидов,находящихся непосредственно под ДНК. Стоит отметить, что предположение о том,что кальциевые мостики могут влиять на взаимодействия между холиновымигруппами липидов и фосфатными группами ДНК было также ранее выдвинутоЖдановым с соавторами при получении спектров ЯМР для синтетических аналоговДНК и липидов.[58].Чтобы оценить влияние связанных мостиков на стабильность контактов холинДНК, было рассчитано время жизни этих контактов во время начальной стадииадсорбции ДНК (первые 100 нс траекторий моделирования). Как можно видеть изРисунка 9, связанные мостики должны иметь минимальное влияние на контактыхолин-ДНКнаначальноминтервалемоделирования,таккакобразованиестабильного мостика требует гораздо больше времени, чем 100 нс.

Действительно, вэтом случае было обнаружено, что время жизни контактов между холиновымигруппами липидов и ДНК падает до 0,66 ± 0.07 нс (т.е. в 5 раз), что подтверждаетвлияние связанных мостиков на более поздних стадиях адсорбции ДНК. Более того,60данный результат приводит к другому важному выводу: нестабильные икороткоживущиевзаимодействиямеждухолиновымигруппамилипидовифосфатными группами ДНК не имеют большого влияния на комплексообразованиеДНК с цвиттерионной липидной мембраной.Стоит отметить, что один ион кальция связывает фосфатную группу ДНК сфосфатными группами нескольких липидных молекул.

Среднее количество липидов,входящих в Ca-связанный агрегат равняется 2.88 ± 0.02. На Рисунке 15а показанораспределение по количеству агрегатов различных типов. Большинство Сасвязанных агрегатов состоит из фосфатной группы ДНК и фосфатных групп трехцвиттерионных липидов ФХ (Рис. 15б). Более того, взаимодействие Pфх и Pднкявляется настолько сильным, что способно изменить локальные структурныесвойства мембраны. Было показано, что неполярные углеводородные цепи липидов,связанных с ДНК при помощи ионов кальция, более разупорядочены по сравнению состальными липидами: параметр порядка для ненасыщенной цепи sn-1 липида,связанного с кальцием, меньше, чем для несвязанного липида. Этот эффект являетсяболее сильным для нижней части цепи (Рис.

16).Такоеразупорядочиваниелипидныхцепейможетбытьобъясненозначительным “вдавливанием” фрагмента ДНК в фазу липид-вода, котороевыталкивает ДНК-связанные липиды к центру мембраны. Исследование профиляплотности фосфолипидов (Рис. 17) показывает, что фосфатные группы, входящие вмостик находятся ближе к центру мембраны приблизительно на 0.35 нм, то есть там,где они имеют больше свободного объема, что и приводит к разупорядочиванию.61Рис.

15 (а) Среднее количество связанных агрегатов различных типов. Агрегатсостоит из фосфатной группы ДНК, иона кальция и нескольких (от 1 до 4)фосфатных групп липидов. Усреднение проведено по последним 200 нстраектории. (б) Типичное представление Ca-ДНК-липидного агрегата. Показанытри липида (зеленый, оранжевый и синий), которые связаны с основанием ДНК(красный) ионом кальция (желтый).