Диссертация (Компьютерное моделирование адсорбции ДНК на липидный бислой, состоящий из молекул фосфатидилхолина), страница 3

Наряду с полиплексами одним из наиболее изученных и перспективных классов в области генных векторов являются комплексы ДНК с липидами. Детальный обзор этих комплексов рассмотрен вотдельном параграфе.1.2. Векторы доставки на основе липосомКатионные липиды являются амфифильными соединениями, которые хорошорастворяются в водной среде и образуют положительно заряженные мицеллярныеструктуры (липосомы). Все катионные липиды имеют общую структуру, состоящуюиз катионной (гидрофильной) головной группы и гидрофобного хвоста, которые соединены линкером. Положительно заряженная голова служит для связывания с отрицательно заряженными фосфатными группами нуклеиновых кислот.

Комплексы, образованные самосборкой ДНК с липосомами принято называть липоплексами. Существует ряд экспериментальных работ, которые показывают, что липиды могут влиять на свойства нуклеиновых кислот, в частности, превращая ДНК из обычной Вформы в А и С-формы. [31, 32]. Тем не менее, впервые в 1987 было показано, что использование комплекса ДНК с липосомами [33] улучшает трансфекцию (переносДНК в клетку с последующей экспрессией), что привлекло повышенное внимание13ученых к изучению липоплексов.

Эффективность трансфекции при помощи липоплексов значительно зависит от структуры катионного липида (длины липида, геометрического соотношения гидрофобного конца и гидрофильной головной группы),свойств дополнительных нейтральных (цвиттерионных) липидов-помощников и ихсоотношения с катионными липидами [34]. Наиболее известные липиды-помощники,холестерол и диолеилфосфатидилэтаноламин (ДОФЭ), добавляют к катионным липосомам для улучшения трансфекции и уменьшения токсичности липоплекса. В зависимости от формы входящего в состав липоплекса липидов разделяют слоистую(ламинарную) и гексагональную структуру липоплекса. В отличие от большинствалипидов, которые имеют цилиндрическую форму и, следовательно, образуют слоистые структуры, липид-помощник ДОФЭ имеет конусообразную форму.

Было показано, что увеличение количества ДОФЭ в липоплексах приводит к гексагональнойструктуре липоплексов, а доставка ДНК в клетку увеличивается за счет слияния липидов с клеточной мембраной, что приводит к освобождению ДНК в цитоплазму [35,36]. Также известно, что эффективность трансфекции ламинарных комплексов зависит от плотности заряда мембраны, в то же время для гексагональных комплексовтакая зависимость не наблюдается. [34].

К настоящему времени считается, чтотрансфекция на основе липосом осуществляется преимущественно за счет эндоцитоза [37]. В данном процессе на первом этапе происходит клеточное поглощение липоплексов, которые затем дестабилизируют эндосомальную мембрану, приводя к диффузной реорганизации фосфолипидов. Эти фосфолипиды затем дифундируют в липоплекс и взаимодействуют с катионными липидами, вызывая освобождение ДНК вцитоплазму. Исследования показали [37], что катионные липиды способны встраиваться в клеточную мембрану, модифицировать функциональность мембранных белков и клетки.

В связи с этим, несмотря на то, что генные векторы на основе катионных липидов являются эффективными невирусными средствами доставки, они также14являются токсичными, что подталкивает исследователей к поиску новых средств доставки ДНК в клетки. Нейтральные липиды являются составной частью клеточныхмембран и, соответственно, нетоксичны. Таким образом, одним из возможных безопасных и эффективных средств доставки ДНК в клетку могут быть векторы на основе нейтральных (цвиттерионных) липидов (вместо токсичных катионных липосом).

Экспериментально было показано, что нейтральные (цвиттерионные) липиды вприсутствии ионов металлов могут вести себя эффективно как катионные, образуякомплекс с ДНК [12, 38 - 44]. Одна из первых работ по изучению эффективности липоплекса на основе цвиттерионного ДОФХ была проведена в 2006, результаты которой показали хоть и низкую, но положительную тенденцию в трансфекции ДНК вклетку, без использования токсичных компонентов [45]. В последующих работах было показано, что смешивание различных цвиттерионных липидов может привести кувеличению трансфекции. Так, например, было показано, что эффективность комплекса 6ПОФЭ-ДОФХ-ДНК-Ca при соотношении липидов 15:1,соответственно, выше в 2,7 раза эффективности вектора на основе катионного липида ДОФХ-ДОТАП,что подтверждает важность исследований липосом на основе цвиттерионных липидов в качестве альтернативы токсичных катионных липидов [47].1.3.

Экспериментальные исследования цвиттерионных липидов и молекул ДНКЛипосома на основе цвиттерионных липидов, состоит минимум из трех составляющих: молекул ДНК, цвиттерионных липидов и положительно заряженныхионов. Такая многокомпонентная система является достаточно сложной для изучения, так как включает в себя, помимо изучения целого комплекса ДНК-липид-катион,отдельные исследования взаимодействия липид-катион, ДНК-катион, ДНК-липид.Что касается системы без ДНК, исследования показывают, что положительно заряженные ионы адсорбируют на нейтральный липидный слой, делая его положительнозаряженным, при этом адсорбция, как и структура липидного слоя, зависит от типа15выбранного иона. Так, только в присутствии двухвалентного кальция везикулы ФХадсорбировали на отрицательно заряженную подложку микроскопа, что не наблюдалось в случае с ионом натрия. Кроме того, морфология везикул различна в присутствии моновалентных и двухвалентных ионов: образование большего количествамногослойных везикул наблюдалось для раствора с ионами натрия, чем с ионамикальция [42].

Это объясняется связыванием кальция с головными группами липида,что приводит к отталкиванию бислоев. Связывание двухвалентных ионов (кальция имагния) с фосфатной группой липида фосфатидилхолина, одного из главных представителей нейтральных фосфолипидов, подтверждается спектральными исследованиями, демонстрирующими частичную дегидратацию [46] и иммобилизацию фосфатных групп [48]. Дополнительно в этом случае были обнаружены конформационные изменения карбонильных групп. В то же время ионы Ba2+ ,Sr2+ ,Na+, K+ слабовлияли на гидратацию и структуру фосфатных групп.

Эксперименты Громельского исоавторов с использованием одновременно кальция/магния и натрия в растворе подтвердили дегидратацию фосфатных групп только при высоких концентрациях кальция, что объясняется конкуренцией моновалентных и двухвалентных ионов [41].Константа связывания фосфатидилхолина с ионами кальция была исследована различными физико-химическими методами: дифракционными методами, калориметрией, ЯМР, ИК спектроскопией, электрофорезом. Эти эксперименты показали, чточем выше степень ненасыщенности углеводородной цепи липида, тем слабее кальций связывается с липидом.

Константа связывания также зависит от состояния липида и экспериментального метода: в гелевом состоянии связывание проявлялосьсильнее, чем в жидкокристаллическом. Также не было замечено различий в связывании ионов магния и кальция с липидами [49].Что касается взаимодействий ДНК с ионами металлов, хорошо известно, чтоионное окружение может сильно влиять на динамику и структуру макромолекулы.16Наглядный пример этого влияния: при высокой ионной силе ДНК может перейти изB-формы в A-форму или даже в Z-форму при наличии GC-богатых участков. Известно, что влияние катионов на структуру ДНК зависит от последовательности оснований в макромолекуле, что проявляется в упаковке и считывании ДНК.

Большинство экспериментальных исследований взаимодействий ДНК-катион включает двухвалентные ионы, в частности из-за более предпочтительного связывания ДНК сдвухвалентными ионами в отличие от щелочных катионов и низкой упорядоченности моновалентных ионов в кристаллах. Щелочноземельные металлы преимущественно связываются с фосфатными группами ДНК, тем самым уменьшая отталкивание между противоположными цепями двойной спирали, стабилизируя полинуклеотид.

Показано, что в кристалле катионы склеивают соседние дуплексы ДНК. Рамановские исследования показали, что сила взаимодействия щелочноземельных металлов с основаниями ДНК относительно фосфатных групп убывает в зависимостиот металла в следующем порядке Hg2+ >Cu2+ >Pb2+ >Cd2+ >Zn2+ >Mn2+ >Ni2+ Co2+ >Fe2+>Ca2+ >Mg2+, Ba2+, а переходные металлы сильно связываются с атомами оснований,что приводит к большим структурным изменениям ДНК [50].

Несмотря на малуюширину малой бороздки, показано, что катионы связываются с атомами обеих бороздок. Методами ЯМР, кристаллографии, ИК спектроскопии установлено, что вбольшой бороздке катионы преимущественно связываются с пуринами: с атомамиO6, N7 гуанина [51-54] или атомом N7 аденина [52]. Кроме того, двухвалентные ионы внутри большой бороздки способны привязывать гуанин к противоположномуоснованию, но преимущественно формирует мостики между гуанин-богатымиучастками.Формирование стабильных комплексов “ДНК-цвиттерионные липиды” происходит в присутствии двухвалентных ионов. Эксперименты по изучению данногокомплекса проводят как в растворе, используя везикулы (методами крио просвечива-17ющей электронной микроскопии, рассеяния нейтронов на малые углы, кругового дихроизма, флуоресцентной микроскопии), так и с использованием модельных монослоев Ленгмюра (методами изотерм, ИК отражательно-абсорбционной, Фурье и рамановской спектроскопий, рентгеноспектрального анализа, брюстеровской микроскопии), исключающих мезофазные структурные изменения.