Диссертация (Системный подход к организации параневральных соединительнотканных структур ветвей плечевого сплетения в эволюционном аспекте), страница 10

В результате было получено математическое60подтверждение зависимости пространственной организации параневрия отместапозвоночногоживотноговфилогенетическомряду,степенидвигательной активности грудной конечности и функциональной ролипараневральных соединительнотканных структур.В качестве объекта исследования были выбраны – средняя треть обеихгрудныхконечностейпресмыкающиеся,птицы,упредставителеймлекопитающиеклассов:(отряды:земноводные,насекомоядные,грызуны, зайцеобразные, хищные, парнокопытные).

Все сравниваемыепозвоночные животные были одного пола, возраста, определение которогопроводили с использованием принципов и методов по Г.А. Клевезаль [81].Забор материала от диких животных проводили во время плановыхмероприятий по регуляции численности популяции.Дляизученияморфологическихособенностейпараневральныхсоединительнотканных структур у представителей указанных классов, вобласти средней трети плеча иссекали органокомплекс, состоящий изпоперечно-исчерченной скелетной мышечной ткани, соединительной ткани,кровеносных сосудов и длинных ветвей периферических нервов плечевогосплетения, иннервирующих мышцы-сгибатели и мышцы-разгибатели.Для изучения влияния степени двигательной активности груднойконечности на ранее указанные структуры периферических нервов, длясравнения были взяты животные одного отряда, относящиеся к однойтаксономической единице, но находящиеся в разных условиях обитания.Сведения о количестве особей и исследуемом материале представлены втаблице 1.В третьей серии исследований был проведен эксперимент на 175крысах – самцах линии Вистар, массой 180-200 гр., которым создавалиусловиянизкойдвигательнойактивностигруднойконечности-«гипокинезии» и высокой – «гиперкинезии».

Условия «гипокинезии»моделировали путем помещения животных в гипокинетические камерыпродолжительностью 7, 14, 21, 30, 45, 60 и 90 суток (патент на полезную61модель № 82085 от 20.04.2009г. «Гипокинетическая камера для мелкихлабораторныхживотных»,удостоверениянарационализаторскиепредложения: «Подставка для гипокинетической камеры» №1853-08 от28.11.2008г., «Универсальная поилка для крыс, находящихся в условияхгипокинезии» №1852-08 от 28.11.2008г.).Таблица 1 - Сведения о количестве особей и исследуемом материалепервой серииУсловия «гиперкинезии» создавали путем ежедневного пребывания(плавания) лабораторных животных в воде, продолжительностью 180 мин, втечение 7, 14, 21, 30, 45, 60 и 90 суток (рисунок 9).

Распределение животныхпо сериям эксперимента представлено в таблице 2.Вэкспериментотбиралиживотныхбезвнешнихпризнаковзаболеваний после двух недельного карантина в условиях вивария ГБОУВПО «Курский государственный медицинский университет» МинздраваРоссии.62Таблица 2 - Сведения о количестве экспериментальных животных иисследуемом материале второй серииРисунок 9 – Гипокинетическая камера для мелких лабораторныхживотных - патент на полезную модель № 82085 от 20.04.2009г.Экспериментально созданные условия «гипокинезии» и «гиперкинезии».63Для морфологического изучения реактивных изменений параневрияпод влиянием разной степени двигательной активности грудной конечностивэкспериментальносозданныхусловияхиопределенияролипараневральных соединительнотканных структур, в области средней третиплеча на медиальной и латеральной поверхностях проводили иссечениенервно-мышечного органокомплекса с использованием микрораспатера(рационализаторское предложение № 1762-07 от 20.05.2007г.).

С помощьюпредложенного инструмента, поднадкостнично осуществляли выделениесосудисто-нервногопучкапериферическогонервов,иннервирующегомышцы-разгибатели. Этот же инструмент был использован и в первой серииисследования при выделении сосудисто-нервных пучков у мелких животных– представителей классов земноводные и пресмыкающиеся. Для дальнейшегогистологического изучения материала, используя предложенный намипрепаровальный столик (патент на полезную модель «Препаровальныйстолик для топографо-анатомического изучения и взятия материала длягистологическогоисследования»,номерприоритетнойзаявки-№2015111428/20(017822), из полученных органокомплексов изготавливалиобразцы размером от 0,5х0,5мм до 15х15мм (в зависимости от размераособи).2.2.

Методы исследованияПолученные от двух серий исследования образцы фиксировалипогружением в 10% забуференном растворе формалина (рН 7,2-7,4) прикомнатной температуре в течение 10 суток. Затем, материал заливали впарафин по стандартной методике, используя предложенные способы:«Способ удаления излишков парафина из металлических кассет» № 1764-07от 18.05.2007г. и «Способ распределения гистологического материала,залитого в парафин на деревянных блоках» № 1908-10 от 19.03.2010г.,микротомировали и изготавливали поперечные гистологические срезысосудисто-нервных пучков с окружающими мышцами, толщиной 8-10 мкм64(рационализаторское предложение «Устройство для нанесения адгезивнойсмеси на предметное стекло» № 1767-07 от 18.05.2007г.).Полученные гистологические препараты маркировали, основываясь напредложенныхспособах:«Устройствоиспособмаркировкигистологического материала различных серий» № 1763-07 от 07.05.2007г.

и«Способ маркировки гистологических препаратов» № 1854-08 от 28.11.2008г.Затем окрашивали гематоксилином и эозином, для обзорного изученияструктурнойорганизациисосудисто-нервныхпучков;дляизученияморфологических особенностей соединительной ткани - по Маллори,пикрофуксином по Ван Гизону, пикросириус красным; альциановым синимдля выявления тучных клеток разной степени зрелости; для качественно –количественного изучения нервных волокон, образующих нервные пучкииспользовали метод Вейгерта-Паля [6, 26, 69, 119, 246, 252].Из части материала второй серии изготавливали тотальные пленочныепрепаратыпараневральнойрационализаторскиесоединительнойпредложенияткани«Устройство(удостоверениядлянавыполненияманипуляций под малыми увеличениями» № 1761-07 от 07.05.2007г. и«Препаровальная игла для изготовления тотальных препаратов» № 1938-10от 15.12.2010г.), окрашивали гематоксилином и эозином и изучали ееклеточный состав, пикросириус красным для изучения волокнистогокомпонента.Окрашенныегистологическиепрепаратымикроскопировалиифотографировали с помощью оптической системы, состоящей из микроскопаLeica CME и окуляр камеры DCM – 510 на увеличениях х100 и х400 крат сдокументированием снимков в программе FUTURE WINJOE, входящей вкомплект поставки окуляр - камеры.В поперечных гистологических срезах, используя рационализаторскоепредложение«Способвизуализацииморфологическихструктурсиспользованием макрофотографий» №1907-10 от 19.03.2010г., при световоймикроскопии, изучали топографические особенности и микроскопическое65строение компонентов сосудисто-нервного пучка, наличие и степеньразвития параневральных соединительнотканных структур на левой и правойконечностях, в филогенетическом ряду [215].На микрофотографиях, с помощью программы Imago J, измеряли:площадь поперечного сечения сосудисто-нервных пучков, нервных стволов(первичных нервных пучков), вторичных нервных пучков, площадьсоединительной ткани, толщину общего фасциального футляра и отходящихстропных элементов, толщину эндоневрия, толщину периневрия первичныхи вторичных нервных пучков, количество миелиновых и безмиелиновыхнервных волокон в стандартном поле зрения, их диаметр и толщину миелина(рисунок 10).

Морфометрическое исследование было проведено с учетомрекомендаций следующих авторов: Г.Г. Автандилов, 1990; С. Гланц, 1999;С.Н. Лапач, 2001; В.П. Леонов, 1997, 2007; О.Ю. Реброва, 2002 [3, 42, 93, 96,97, 152].Рисунок 10 – Морфологические структуры сосудисто-нервного пучкапериферических нервов сгибателей в области средней трети плеча,количественно оцениваемые с использованием программы Imago J.66Полученные цифровые данные (выраженные в пикселях) былипереведены в мкм и мм (мкм2; мм2) при помощи деления пикселей накоэффициенты, специально для этого выведенные: объективы х4 – 1018333,х10 – 6379251, х40 – 98911797.С целью объемного изучения поверхности среза периферическихнервов и окружающих их оболочек с кровеносными сосудами, былиспользованметодэлектроннойрастровоймикроскопиинабазеМеждисциплинарного нано технологического центра ФГБОУ ВПО «КурскийГосударственный университет», согласно методическим рекомендациям M.Dufek, 2010 [255].

В начале исследования проводили пробоподготовкуобразцов(полученприоритетныйномернаизобретение-№2015115068/15(023550) от 30.06.2015г. «Способ пробоподготовки образцовбиологическихтканейдляисследованияметодоматомно-силовоймикроскопии»), затем материал помещали на токопроводящий углеродныйскотч в камеру электронного растрового микроскопа Quanta 650 FEG. Врежиме вторичных электронов детектором Эверхарта - Торнли в режимевысокого вакуума от 8∙10-3 до 3∙10-3 Па с ускоряющими напряжениями 1,5-2кВ, при относительном диаметре пучка величиной 0,1 нА были полученыизображениякровеносныхсосудовсоединительнотканныхоболочекпериферических нервов, периневрия, самих нервных пучков и нервныхволокон.Впроцессеисследованияосуществлялифотографированиеучастков изучаемых структур с одновременным нанесением размернойшкалы.С целью изучения микрорельефа невральных оболочек, в том числе ипараневральных соединительнотканных структур был применен методатомно-силовой микроскопии, выполненный на сканирующем зондовоммикроскопе«СОЛВЕРНЕКСТ»(НТ-МДТ,Россия)[121,182].Вполуконтактном режиме с использованием кремниевых кантилеверов серииNSC19/Cr-Au (μmasch, Эстония), имеющих следующие характеристики:радиус закругления зонда – менее 40 нм; длина кантилевера - 125±5 мкм;67резонансная частота от 52 до 113 кГц; жесткость от 0,17 до 1,7 Н/м; толщинаметаллического покрытия Cr-20 нм, Au – 20 нм, были получены сканымикрорельефа поверхности образцов периневрия, общего фасциальногофутляра, стропных элементов.