Диссертация (Разработка, стандартизация и изучение биологической активности плёнки спермицидного действия, на основе сапонинов Styrax Officinalis L), страница 8

Методы исследования2.2.1. Фармакогностический анализ сырьяМакроскопический анализ сырья стиракса лекарственного выполняливизуально. Фотографии делали с помощью цифрового фотоаппарата CasioExlim16,1 Мп, зум 5x (оптический), 4x (цифровой), 4,6-23,0 mm, 1:3,2-6,5.Размерыопределяли с помощью линейки или сантиметровой ленты используя методикуГФ XIII.Фотографии обрабатывали в программе AdobePhotoshop CS6.Микроскопический анализ цельного сырья проводили согласно статьеОФС.1.5.3.0003.15исследования«Техникалекарственногомикроскопическогорастительногоисырьямикрохимическогоилекарственныхрастительных препаратов» ГФ XIII изд.

на микроскопе Ломо, МИКМЕД (Россия).Были приготовлены поверхностные, продольные и поперечные срезы семян,семенной кожуры и околоплодников Styrax officinalis L.Изготовлениюмикропрепаратовпредшествовалэтапразмачивания,состоящий из помещения исследуемых растительных образцов на сутки в воду,затем в смесь глицерин : вода : этанол (1 : 1 : 1) на 3 суток.Микропрепарат экзокарпа получали, отрезая с помощью скальпеля илилезвия узкие лоскуты околоплодника, шириной около 2 мм, движением отверхушки к основанию плода, после чего осторожно снимали тонкий слойэкзокарпа, как можно полнее отделяя его от ткани мезокарпа.

Полученные срезыбыстро переносили на предметное стекло и добавляли каплю воды или растворахлоралгидрата, осторожно расправляли препаровальными иглами и накрывалипокровным стеклом.Микропрепараты мезокарпа готовили с помощью препаровальной иглы ипинцета. Кусочки мякоти плода помещали на предметное стекло в каплюраствора хлоралгидрата или воды, осторожно прижимали препаровальной иглой,после чего накрывали покровным стеклом.Для изготовления микропрепарата из семенной кожуры необходимо иметьпод рукой нож или ножницы, пинцет и препаровальные иглы.

Посколькусеменная кожура стиракса остаётся очень твердой даже после недели45вымачивания в растворе (глицерин : вода : этанол) (1:1:1), невозможно делатьсрезы, поэтому при помощи ножа или ножниц отламывали маленькие кусочкикоторые помещали в каплю воды или раствора хлоралгидрата.Наличие крахмала определяли обрабатывая микропрепататы растворомЛюголя.Обнаружение жирных масел проводили под микроскопом по реакцииокрашивания с раствором Судана III: готовые срезы помещали в 2 -3 каплираствора Судана III, накрывали покровным стеклом и нагревали.Микроскопический анализ анатомических особенностей плодов стираксалекарственного проводили с помощью микроскопа «Ломо, МИКМЕД – 1» собъективами х 3,2; х 9; х 40; и окуляром 10х.

Микрофотосъемка проводилась спомощью цифрового фотоаппарата Canon powershot A85 – Ai AF (zoomlens 3x5,4-16,2 mm, 4,0 mega pixels) на микроскопе с различными объективами.Фотографии обрабатывали в программе Adobe Photoshop CS6.Изучение анатомии высушенных плодов стиракса лекарственногоВГосударственнойфармакопееXIIIизданияописанатехникамикроспопического анализа ЛРС методом оптической микроскопии (ОМ). Дляболее подробного и углубленного изучения анатомических особенностей встроении плодов стиракса лекарственного мы, помимо оптической микроскопиииспользовали сканирующую электронную микроскопию (СЭМ).В настоящее время, в НД на ЛРС, принято приводить в качестве материаламикрофотографии [1]. Анализ научной литературы и нормативной документациипо ЛРС показывает, что фотографии имеют большую практическую ценность и,что, немаловажно, должны в обязательном порядке быть снабжены информациейоб использованных объективах и окулярах, т.е.

об увеличениях [11]. Приумножении увеличения объектива на увеличение окуляра рассчитывается общееувеличение, оно и подписывается на все публикуемые рисунки и фотографии.Также с применением цифровых фотоаппаратов нужно обязательно учестьувеличение объектива фотоаппарата для расчета окончательного значения46увеличения. Для удобства масштабирования и интерпретации полученных намифотографий мы размещали на них масштабную линейку.

С ее помощью можнолегко провести определение размеров анатомических признаков.Микроструктурный анализ (Электронная микроскопия)ИсследованиепроводиливЦКП(НОЦ)РУДНнасканирующемэлектронном микроскопе JEOL JSM – 6490LV при 30kV, детекторе SEM, размереэлектронного пучка 30, в высоком вакууме. Благодарим канд. фарм. наук ХомикА.С. за помощь и содействие проведенных исследований.Образцы перед проведении съемки покрывались слоем платины (24 нм) (50сек при 40 мА) в автоматическом коутере JEOL (JFC – 1600).2.2.2. Методы определения показателей качества сырья• Размеры частиц измельченного растительного сырья (околоплодниковстиракса) определяли, с помощью набора сит с отверстиями размером: 2,5; 2; 1;0,5; 0,25 мм и диаметром 14 см.

Просев осуществляли с помощьюавтоматического вибропривода в течении 5 минут.• Определение влажностиАнализпроводилсясогласноОФС.1.5.3.0007.15.Дляопределениявлажности измельченных высушенных околоплодников стиракса лекарственногобыл использован влагомер термографический инфракрасный (Аквилон АВ-50).• Общая зола и зола нерастворимая в хлористоводородной кислотеНа основании общих фармакопейных статей ОФС.1.2.2.2.0013.15 иОФС.1.5.3.0005.15 ГФ XIII, проводили определение общей золы измельченных(до размера частиц не более 2 мм) и с использованием около 5,0000 г высушенныхоколоплодниках стиракса (точная навеска). Определение золы нерастворимой вхлористоводородной кислоте проводили на остатке после определения золыобщей с использованием беззольного фильтра (Белая лента, МЕЛИОР XXI, массазолы одного фильтра не более 0,00029 г.).47•Определениерасходногокоэффициентакоэффициентапоглощениярастительноговоды/экстрагентасырьяивысушенныхоколоплодников стиракса лекарственногоОпределение проводили согласно ОФС.1.5.3.0012.15.

Для определениякоэффициента поглощения различных экстрагентов, около 10,0 г (точная навеска)измельченных высушенных околоплодников заливали экстрагентом:водойочищенной/ метанолом/ спиртом 96% с отношением сырьё:экстрагент (1:10). Всоответствии с ОФС.1.4.1.0018.15 «Настои и отвары» и с ОФС.1.4.1.0019.15«Настойки». Полученные извлечения фильтровали и отжимали оставшееся сырьев перфорированном стакане, после чего измеряли объем полученного извлечения.Коэффициент эктрагент-поглощения: кэп=1 −2а;где: V1– объем эктрагента, мл; V2– объем извлечения, который был полученпосле отжатия сырья, мл; a – навеска сырья, г.• Определение содержания экстрактивных веществ в сырье околоплодники стиракса лекарственногоДля определения содержания суммы биологически активных и балластныхвеществ в сырье околоплодники стиракса лекарственного, использовали согласноОФС.1.5.3.0006.15 метод 2 – многократную экстракцию.Методика: Около 6,0 г (точная навеска) высушенных (с определеннойвлажностью W%) измельченных (с размерами частиц не более 1 мм)околоплодников стиракса лекарственного, помещают в колбу вместимостью250 мл, 30 мл метанола растворителя.

Колбу взвешивают и проводят первичнуюмацерацию сырья в течении 1 ч, после чего присоединяют обратный холодильники нагревают на водяной бане в течение 2 ч. После охлаждения взвешивали колбу ссодержимым и восполняли растворителем потерю в массе. Затем взбалтываютколбу и фильтруют содержимое через бумажный фильтр. Эту процедуруповторяют 3 раза, каждый раз прибавляя фильтрат обратно в колбу. Фильтратыобъединяют, отбирают 10,0 мл и высушивают пробы досуха при температуре48100 °С, затем охлаждают в течение 30 мин в эксикаторе и взвешивают сухойостаток (m).Содержание экстрактивных веществ в сухом сырье околоплодниковстиракса лекарственного рассчитывают по формуле:= .

100 . 100 . (30 . 3);6 . (100−) . 10где: m — масса сухого остатка, г;W — влажность сырья, %.2.2.3.Методикавыделенияиочисткисуммысапониновизоколоплодников стиракса лекарственногоВыделениесуммысапониновосуществлялосьсиспользованиемциркуляционной экстракции в аппарате Сокслета. Около 60,0г (точная навеска)измельченного сырья помещали в патрон из фильтровальной бумаги, иэкстрагировали метанолом (400 мл) в течение 10 ч.

Затем экстракт упаривали нароторном испарителе Heidolph® Laboratory 4002 control (337 мБар, температура 40± 5°С) до получения густого экстракта. Затем, густой экстракт очищалиэтилацетатом и н-бутанолом. Густой экстракт обрабатывали этилацетатом (1:10вес / объем) в течение 6 часов при перемешивании, полученную смесьфильтровали.

Этилацетат удаляли с помощью роторного испарителя (температура40°С, 240 мБар). Остаток обрабатывали н-бутанолом 10% в пропорции (1:30 вес /объем) в течение 3 часов при перемешивании. Затем после удаления слоя нбутанолапроводилипереосаждениесапониновприподкисленииконцентрированным раствором хлористоводородной кислоты до pH = 1,0. Осадоксапонинов отделяли фильтрацией с последующей сушкой [Брежнева Т. А., 2003].2.2.4. Определение растворимости сухого экстракта (групп БАВ)Для изучения растворимости БАВ (суммы сапонинов) сухого экстрактаоколоплодников стиракса лекарственного использовали полярные и неполярныеорганические растворители такие как вода очищенная, метанол, спирт этиловый,глицерин, пропиленгликоль, ацетон, диметилсульфоксид, полиэтиленгликоль-400,49хлороформ, н-бутанол.

Проводили изучение растворимости по методике ГФ XIII(ОФС 1.2.1.0005.15), с постепенным добавлением растворителя в соотношении1:1, 1:10, 1:30, 1:100 и 1:1000.2.2.5. Определение технологических характеристик сырьяОпределение степени сыпучести сухого экстрактаСтепень сыпучести порошка зависит от дисперсности, формы частиц иостаточной влажности. Мы определяли эту комплексную технологическуюхарактеристику по двум критериям: сыпучесть и насыпной объем. Определениестепенисыпучестипорошкасухогоэкстракта околоплодников стираксалекарственного проводили по методике ГФ XIII (ОФС 1.4.2.0016.15) на аппаратеERWEKA Granulate Flow Testers GT (Германия) в лаборатории ЦКП (НОЦ)РУДН.