Диссертация (1141387), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Навеску порошка массой 50 г, полученную путем экстракции суммы БАВстиракса лекарственного, помещали без уплотнения в воронку аппарата ErwekaGT с закрытым выходным отверстием (10, 15, 25 мм). Затем открывали выходноеотверстие воронки и определяли время, за которое весь образец пройдет черезотверстие воронки. Процесс повторили 3 раза.Определение насыпного объема проводили по методике ГФ XIII (ОФС1.4.2.0016.15) на аппарате ERWEKA SVM 101/201 Tapped Density Tester(Германия) в лаборатории ЦКП (НОЦ) РУДН.
В сухой цилиндр помещали (безуплотнения) навеску 33,39 г порошка сухого экстракта стиракса лекарственного иопределили насыпной объем V0 мл, который был равен 78 мл. Затем производили10, 500 и 1250 соскоков цилиндра и фиксировали объемы после уплотнения V 10,V500, V1250.
Полученные результаты можно использовать для вычисленияпоказателей:Объёмная плотность (Bulk density):о =m— масса сыпучего материала, г;00 —объем порошка передуплотнения, мл.; где50Насыпная плотность (Tapped density):н =m— масса сыпучего материала, г;; гдеV—объем порошка после уплотнения, мл.Коэффициент прессуемость (Carr's Index - CI%):Кпр =Рн −Р0Рн. 100 =0 −0Соотношение Хауснера (Hausner Ratio):Х=РнР0.
100 ; %.2.2.6. Качественное определения сапонинов в СЭСЛДля подтверждения наличия сапонинов в сумме экстрагируемых веществ,проводились реакции идентификации.1. Качественная реакция, основанная на физических свойствах сапонинов Реакция пенообразования: довольно характерная реакция, так как других веществ,обладающих способностью к пенообразованию кроме сапонинов, в растениях невстречается.
Методика: по 0,5 мл водного раствора экстракта околоплодниковстиракса лекарственного помещают в две пробирки (мерные, с одинаковымдиаметром). В одну из пробирок помещают 5мл раствора кислотыхлористоводородной 0,1М, в другую - 5 мл раствора натрия гидроксида 0,1М. Обепробирки интенсивно встряхивают в течение 1 мин. Проводят измерение высотыстолбика пены в обеих пробирках [8, 9].2.Качественнаясапониновреакция,основаннаянабиологическихсвойствах- Рeaкция гeмoлизa.
Методика: 0,2 г сухого экстракта стираксалекарственного растворяют в 5 мл изoтoнического рacтвoра нaтрия xлoридa,добавляют полученный раствор к 1 мл взвecи дeфибринирoвaннoй крoви. Вконтрольную пробирку к 1 мл взвecи дeфибринирoвaннoй крoви добавляют 5 млизoтoничecкого рacтвoра нaтрия xлoридa [8, 9].51Раствор для гемолиза готовится следующим образом: полученная отдобровольца кровь обрабатывается раствором антикоагулянта – натрия стеарата3,2% (Vacuette, greiner bio-one), подвергается центрифугированию, после чегосливается надосадочная жидкость – плазма. Далее добавляют физиологическийраствор и пробирку аккуратно переворачивают несколько раз таким образом,чтобы не допустить механического разрушения.
Затем полученную смесьцентрифугируют (2500-3000 об / мин в течение примерно 1-2 минут) и производятзамену физиологического раствора на чистый, так как предыдущий содержитбелки, лейкоциты и другие компоненты крови. Процедуру повторяют до момента,пока надосадочная жидкость не станет прозрачной и чистой.3. Качественные реакции, основанные на химических свойствах сапониновК 0,2 г. сухого экстракта СЭСЛ прибавляют 1 мл хлороформа и 5 капельконцентрированной серной кислоты. Появиться желтое окрашивание, постепеннопереходящее в красное окрашивание (тритерпеновые сапонины) [ТУ 9377-07504868244-2008].Другие качественные реакции, основанные на химических свойствахсапонинов (Цветные реакции) мы проводили с реактивами: раствором кислотысернойконцентрированной,растворомванилинаикислотысернойконцентрированной при нагревании (реакция Санье), хлороформом с кислотойсерной концентрированной (реакция Сальковского) [8, 9].2.2.7.
Методика количественного определения сапонинов в сухомэкстракте – 1Н ЯМРНа основании ГФ ХIII (ОФС.1.2.1.1.0007.15), количественная спектроскопия1Н ЯМР считается надёжный методом определения содержания ЛС в отсутствиестандартного образца с использованием сигналов введенного в аналит любогокалибровочного соединения в известной концентрации.В ходе исследований была использована методика1Н ЯМР дляколичественного определения сапонинов в сухом экстракте.
Исследованиепроводились на приборах 1Н ЯМР - спектрометр (JEOL, Япония) «Jeol JNM-ECA52600» и «Jeol JNM-ECS 400», на базе Центра коллективного пользования ЦКП(НОЦ) РУДН. Благодарим Ивлева В. А. за помощь в количественномопределении.Методика: Проведен анализ сухого экстракта стиракса лекарственного насодержание сапонинов методом количественной спектроскопии ЯМР1Н. Кточной навеске 46,3 мг сухого экстракта стиракса лекарственного (СЭСЛ)добавляют 1 мл DMSO-d6, встряхивают в течение 1 минуты, центрифугируют втечение 5 минут при 14000 об/мин. Раствор переносят в стандартную ампулу дляЯМР d=5 мм. Регистрируют спектр 1Н ЯМР при следующих условиях: 90ºимпульс, смещение 5 м.д., развертка 15 м.д., 32 К точек на спектр, 32 повторений,задержка между импульсами 40 с.Определение содержания сапонинов проводят сравнением интегральнойинтенсивностиоткалиброванногопоостаточномусодержаниюпротонсодержащего изотопа DMSO-d6, и сигналов сапонинов, описанных в статьеY.
Yayla et al. (2002 г.) (Таб. 2.2.). Условия регистрации спектра ЯМР 1Нсапонинов образца были такими же, как и для стандартного образца в статье.Таблица 2.2. – Результаты 1Н ЯМР сапонинов стиракса А, В, С идезацилсапонин - Y. Yayla 2002 г.53Для сапонина В был выбран сигнал при 5.94 м.д., для сапонинов А и Свыбрана совокупность сигналов в области 5.70-5.8 м.д и 5.41 м.д. Сигналовдезацилсапонина, не перекрывающихся другими сигналами, не обнаружено.Для количественного определения измерют интегральную интенсивностьсигналов сапонинов стиракса.
Процентное содержание каждого сапонина виспытуемом образце в пересчете на сухое вещество (X, % масс) вычисляют поформуле:X, % масс= 100 ∙ (S' /S'0) ∙ (M ∙ a0 /M0 ∙ a) ∙ [100/(100 – W)],S' –нормированноегдезначениеинтегральнойинтенсивностисигналазначениеинтегральнойинтенсивностисигналаопределяемого вещества;S'0 –нормированноестандарта;M – молекулярная масса определяемого вещества;M0 – молекулярная масса;a – навеска испытуемого образца;a0 – навеска вещества-стандарта;W – содержание влаги, %.2.2.7.1. Валидация методики количественного определения сапонинов всухом экстракте – ЯМР 1НПроводимое нами исследование требует разработки новых методикконтролякачестваполученнойлекарственнойсубстанции,обязательнымтребованием к которым является их валидация.Проведенная валидация демонстрирует, что методика количественногоопределения сапонинов в сухом экстракте с помощью 1Н ЯМР- спектроскопиипригодна и соответствует заложенным критериям приемлемости.Валидацию проводили по следующими аналитическими параметрам:● Специфичность (Specificity)Способностьметодикиоднозначнооцениватьактивныевещества(сапонины стиракса) в присутствии других компонентов, которые могутприсутствовать в образце.54Критерии приемлемости и их оценка:1- Примесные соединения:А)Должныотсутствоватьпики,которыемешаютопределениюанализируемых веществ.
Оценка критерия: на хроматограмме – ЯМР1Н суммысапонинов стиракса нет никаких сигналов, мешающих определениюпиковсапонинов стиракса А, В, С.Б) На 1Н ЯМР ــспектре образца сапонинов не должно быть пиков,принадлежащих растворителю и имеющих такие же сигналы (м.д.).Оценка критериев была достигнута при использовании сухого экстрактасапонинов и DMSO-d6 в качестве растворителя для подготовки образцов для1Н ЯМР.2) Содержание основных веществ: интенсивность сигналов спектра ЯМР 1Ниспытуемогообразца,должнасоответствоватьинтенсивностисигналовстандартного спектра ЯМР1Н.Оценка критерия: на 1Н ЯМР ــспектре образца сапонинов, сигналы вобласти 5,41-5,74 м.д. и при 5,73 м.д.
соответствуют сапонинам стиракса 1(А) и 3(С). Сигналы при 5,94 м.д. соответствуют сапонину стиракса 2 (В). Условиярегистрации стандартного спектра ЯМР1Н (Y.Yayla et al. / Fitoterapia 73 (2002)320-326) были такими же, как и для наших образцов (1Н ЯМР-спектрометры, 500MHz и 125 MHz, растворитель DMSO-d6).● Сходимость/повторяемость (convergence)Критерий сходимости характеризует прецизионность методики при еевыполнении в одних и тех же условиях с одним и тем же аналитиком в течениенебольшого промежутка времени.
В течение одного дня, один лаборантисследователь проводил 5 измерений количественного содержания сапонинов вэкстракте для одного и того же образца с помощью ЯМР-1Н.Критерии приемлемости и их оценкаОтносительное стандартное отклонение (Sr%) при оценке сходимостиполученных результатов определения содержания сапонинов стиракса в сухомэкстракте должно быть ≤ 5 % (α=0,05).55Результаты определения количественного содержания сапонинов стиракса иих статистической обработки представлены в таблице 2.3.Таблица 2.3. – Математическая обработка результатов измерений ииспытания сходимости методики№ образца xiПоказателиМассовое содержание сапониновстиракса в сухом экстракте, %1234528,329,129,428,729,3х̅-среднее массовое содержаниесапонинов стиракса в сухом экстракте, %( − х̅)228,960,4350,019Стандартное отклонение SОтносительное стандартное отклонениеSr%√0,193 0,067 0,1150,829= 0,45540,455× 100 = 1,57128,96Sr% ≤ 5→ удовлетворяет требованиямПриемлемость результатов● Точность (Accuracy)Методика количественного определения сапонинов в сухом экстрактедолжна обеспечивает требуемую точность оценки показателей.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
