Диссертация (Разработка, стандартизация и изучение биологической активности плёнки спермицидного действия, на основе сапонинов Styrax Officinalis L), страница 11

Опыты проводят в трех повторностях.2)- Определение фунгистатической активностиС целью изучения жидких экстрактов готовили ряд опытных пробирок с 2мл среды (Сабуро) и в 1-ю пробирку добавляли 2 мл изучаемого экстракта,изначально разведенного 1:2, и получая таким образом исходное разведение 1:4.Затем, путем последовательного разведения экстракта в питательной среде в 2раза готовили ряд убывающих разведений.62Методика: При изучении сухого экстракта навеску препарата около 32 мг(точная навеска) взвешивают на торсионных весах, переносят в стерильнуюпробирку и стерилизовали в течение 1 часа 96% спиртом (чтобы субстанция былаполностью покрыта спиртом).

Затем в эту пробирку добавляют соответствующуюпитательную среду в количестве 4,0 мл, необходимым для создания исходнойконцентрации препарата – 8000 мкг/мл. В остальные пробирки добавляют по 2мл питательной среды и затем, путем двукратных разведений, готовят рядыубывающих концентраций препарата (опытные пробирки). Последняя пробирка счистой средой (без добавления экстракта) служит контролем. После этого всепробирки (опытные и контрольные) засевают культурами микроорганизмов.Взвесь грибов готовят в изотоническом растворе натрия хлорида побактериальному стандарту мутности ОСО 42-28-85-2014 (10 МЕ) (109 микробныхтел/мл), затем полученную взвесь разводят изотоническим раствором натрияхлорида в 20 раз. В опытные и контрольные пробирки засевают по 0,2 млполученнойвзвеси.Посевыинкубируютпритемпературе30-32°С:дрожжеподобные грибы – в течение 48 часов, мицелиальные грибы − в течение 10– 14 суток.

Опыты проводят в трех повторностях.Бактериостатическийифунгистатическийэффектопределялипоминимальному, подавляющему рост бактерий и грибов разведением экстракта,при котором визуально не наблюдали роста микроорганизмов.Исследованиеспецифическойактивностиибиологическойбезвредности лекарственных форм в опытах in vivoА- Изучение контрацептивного действия лекарственного средства наоснове сапонинов из околоплодников стиракса лекарственногоНа базе Центра коллективного пользования (Научно-образовательныйцентр)(ЦКП(НОЦ))контрацептивногоРУДНдействияиививарияРУДН,биологическойпроведенобезвредностиизучение(отсутствиеместнораздражающего действия) образцов лекарственных препаратов на основе63сухого экстракта околоплодников стиракса лекарственного.

Благодарим к.в.н.Карамян А. С. за помощь в работе.Эксперименты выполнялись на крысах.Условия содержания животных: стандартные условия вивария, размещениегруппами в промаркированных клетках с регулярно заменяемым подстилом, сосвободным доступом к воде и пище, в условиях стандартизованного светового итемпературного режимов.Каждаягруппасостоитиз10особей(5самцов,5самок).Экспериментальная группа (опыт) состоит из 15-ти особей (5 самцов, 10 самок).Выбор доз осуществлялся, согласно результатам изучения спермициднойактивности средства в опытах in vitro.Вид:Белые крысыИсточник:ООО «КролИнфо»Масса тела к началу:180-200 гВозраст:30-32 нед.Количество:50Пол:самцы, самкиДлительностькарантина(акклиматизационногопериода)длявсехживотных составляла 14 дней.

В течение карантина проводили ежедневныйосмотр каждого животного (поведение и общее состояние), дважды в деньживотных наблюдали в клетках (заболеваемость и смертность). Перед началомисследования животные, отвечающие критериям включения в эксперимент, былираспределены на группы с помощью метода рандомизации. Животные, несоответствующие критериям, были исключены из исследования в течениекарантина.Клетки с животными были помещены в отдельные комнаты.Световой режим: 12 часов — свет, 12 часов — темнота. Температуравоздуха поддерживалась в пределах 19–25°C, относительная влажность — 50–70%. Температура и влажность воздуха регистрировались ежедневно.

Приизменении погодных условий контролировался воздухообмен в помещении с64помощью анемометра и путем измерения содержания в воздухе углекислого газаи аммиака. Был установлен режим проветривания, обеспечивающий около 15объемовпомещениявчас,концентрациюCO2неболее0.15 объемных %, аммиака — не более 0.001 мг/л.В течение исследования каждое животное осматривалось ежедневно.Осмотр включал в себя оценку общего поведения и общего состояния животных.При введении препарата осмотр проводился примерно через 1 час после введения.Былоизученоконтрацептивноедействиеудобногодлявведенияполуфабриката- геля ВСПЭС с 1,5 % содержанием СЭСЛ в опытах in vivo на 45половозрелых крысах (25 самок и 20 самцов) массой 200 ± 50 г., Возраст:8месяцев.

Животные самки были распределены на 4 группы (Животныераспределялись по группам случайным образом методом рандомизации):1. контроль I (5 самок): интактные животные (без введения препаратов);2. контрольII(5самок):экспериментальныеживотные,которымвводили вагинально основу геля «Плацебо-гель»;3. подопытная группа с препаратом - сравнения (5 самок): экспериментальныеживотные,которым вводили вагинальный крем Фарматекс® (лаборатория ИннотекФранция);4. подопытная группа (10 самок): экспериментальные животные, которымвводили вагинально 1,5 % гель сапонинов стиракса.При изучении контрацептивного действия in vivo на крысах препаратывводили самкам интравагинально перед помещением их с самцами в количестве 1мл препарата с помощью зонда (катетера ректального, Ассомедика, Беларусь) иинсулинового шприца (BD Micro-Fine Plus) 1,0 мл (одна самка крысы с пятьюсамцами крыс в каждой клетке) в течение 15 дней.

При отсутствии коитуса через1 часа введение препаратов повторялось.Дляполногоподтверждениябеременностиилиееотсутствияориентировались на ожидаемый срок беременности крыс и только при отсутствии65впоследствии родов (по истечению срока) делали заключение о контрацептивномдействии препаратов.Б- Исследование биологической безвредности ВСПЭС в опытах in vivo(отсутствие местнораздражающего действия)Для исследования местнораздражающего действия ВСПЭС, у животных вгруппе контроля II «гелевая основа» и подопытной группе до и послеэксперимента, и перед каждым нанесением разрабатываемой лекарственнойформы (гель с 1,5 % содержанием сухого экстракта стиракса лекарственного) игелевая основа обследовали для выявления раздражений, гиперемий или любыхвозможных повреждений, кожных инфекций.Результаты данного изучения представлены в главе 6.2.2.9.

Изучение стабильности лекарственных формОдним из обязательных требований при разработке новых лекарственныхформ является исследование их стабильности при хранении. За это время недолжны образовываться токсичные продукты разложения или изменяться физикохимические свойства лекарственного вещества или лекарственного препарата.Исследования стабильности вагинальных пленок, содержащих суммусапонинов, выделенных из околоплодников стиракса лекарственного в процессехранения проводились по показателям: описание, растворимость, подлинность,рН, количественное содержание суммы БАВ, микробиологическая чистота имасса содержимого упаковки.Хранениевагинальныхпленок,содержащихсуммысапониновизоколоплодников стиракса лекарственного, осуществляли при температуре 1530 °С и относительной влажности окружающего воздуха 60±5%в термостате ТС1/20 СПУ (Россия).Микробиологическое исследование лекарственной формыДля исследования микробиологической чистоты лекарственной формы(пленки) при интравагинальном применении использовали требования ГФ XIII,ОФС 1.2.4.0002.15 «Микробиологическая чистота» категории 2: общее число на 1пленке допускается не более 100 колониеобразующей единицы суммарно66аэробных бактерий и дрожжевых и плесневых грибов, при отсутствииPseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, энтеробактерий, устойчивых кжелчи и Candida albicans.По результатам анализа антимикробной активности сухого экстрактаоколоплодников стиракса лекарственного Styrax officinalis L.

в опытах in vitro(результаты данного изучения представлены в главе 6), было установлено, чтосухой экстракт стиракса лекарственного обладает антимикробным действием.Поэтому была проведена нейтрализация антимикробного действия (разведение намембране). После фильтрации через мембранные фильтры (номинальный размерпор не более – 0,45 мкм) фильтры переносили на поверхность агаризованныхпитательных сред и инкубировали. Подсчет выросших колоний проводили на 1, 2и 3 день инкубации.Определение микробиологической чистоты проведено с использованиеммембранных фильтров с размером пор – 0,22 мкм, диаметром 90 мм (ФИЛЬТРГАРАНТ, Россия) и микробиологических экспресс-тестов (Биоконтроль, Россия)дляопределениястафилококков,определенииКМАФАнМ,листерий,дрожжей/грибов,кишечныхмикробиологическойпалочек.чистотыплесени,Условияпредставленысальмонеллы,инкубациивпритаблице 2.7.Результаты данного исследования представлены в главе 6.Таблица 2.7.

– Условия инкубации при определении микробиологическойчистотыНазвание микроорганизмовВремяинкубации(час)КМАФАнМ24Грибки, дрожжи, плесень72Salmonella /Listeria monocytogenes48при +35 ºСStaphylococcaceae48при +35 ºСListeria monocytogenes48при +35 ºСE.coli24при +35 ºСТемпература инкубации (ºС)при комнатной температуре(+22 - +25ºС)при комнатной температуре(+22 - +25ºС)672.2.10. Математические методыи статистическая обработка результатованализаРезультаты обработатывали с помощью программы StatisticaMSExsel.n– число измерений;xi– данные отдельных измерений;∑ f=n–1̅ =∑( − ̅)2√=−1 % =P. 100̅T (p, f)– среднее значение из n измерений;– число степеней свободы;– стандартное отклонение;– относительное стандартное отклонение;–коэффициент надежности(доверительная вероятность);– критерий Стьюдента.68ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ГЛАВЕ 21.

Сапониныстираксалекарственногоизучалисьсовременнымиметодами.2. Для разработки и изучения лекарственных форм спермицидногодействия в качестве активной фармацевтической субстанции выбрана суммасапонинов стиракса лекарственного сухого экстракта.3. Вспомогательные вещества для разработки новых дозированныхлекарственных форм с сапонинами стиракса представлены различнымиингредиентами, разрешенными для фармацевтического использования ивыпускаемые предприятиями фармацевтической отрасли.4. Вработеиспользованысовременныеметодикианализаприразработке лекарственных форм и всестороннее изучении активности in silico,in vitro и in vivo.69ГЛАВА 3. ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ СЫРЬЯ«ОКОЛОПЛОДНИКИ СТИРАКСА ЛЕКАРСТВЕННОГО» И РАЗРАБОТКАМЕТОДИК КОНТРОЛЯ ЕГО КАЧЕСТВАВвиду того, что создание контрацептивных средств для Сирийских женщиниз отечественного сырья является актуальным, дальнейшей нашей задачей былофармакогностическое изучение сырья, составление разделов НД на новый видсырья и последующее выделение из него суммы сапонинов.Прежде чем заниматься разработкой технологии лекарственного препаратанеобходимо получить активную субстанцию.