Диссертация (Разработка, стандартизация и изучение биологической активности плёнки спермицидного действия, на основе сапонинов Styrax Officinalis L), страница 10

Для определенияточностиметодикиготовили5параллельныхобразцовипроводиликоличественное определение сапонинов в сухом экстракте методом ЯМР 1Н.Критерии приемлемости и их оценкиОтносительное стандартное отклонение (Sr%) при оценке точностиполученных результатов определения содержания сапонинов стиракса в сухомэкстракте должно быть ≤ 5 % (α=0,05).Результаты определения количественного содержания сапонинов стиракса в5 параллельных образцов и их статистической обработки представлены в таблице2.4.56Таблица 2.4. – Математическая обработка результатов измерений ииспытания точности методикиПоказателиМассовое содержание сапониновстиракса в сухом экстракте, %х̅-среднее массовое содержаниесапонинов стиракса в СЭСЛ, %( − х̅)2№ образца xi1234530,430,129,328,329,70,0190,06729,561,587Стандартное отклонение S0,291√Относительное стандартноеотклонение Sr%0,7052,669= 0,81640,816× 100 = 2,729,3Sr% ≤ 5→ удовлетворяет требованиямПриемлемость результатов● Воспроизводимость (Reproducibility)Воспроизводимость результатов анализов отражает близость результатовизмерений, выполняемых в различных условиях по данной методике.

Например, вразличное время, в различных местах или на различных приборах.Для определения воспроизводимости нашей методики проводили анализколичественного определения сапонинов стиракса из одного и того же образца надвух разных ЯМР-спектрометрах, «Jeol JNM-ECA 600» и «Jeol JNM-ECS 400».Критерии приемлемости и их оценкиОтносительноестандартноеотклонение(Sr%)приоценкевоспроизводимости полученных результатов определения содержания сапониновстиракса в сухом экстракте должно быть ≤ 5 % (α=0,05).Результаты определения количественного содержания сапонинов стираксана двух разных ЯМР-спектрометрах и их статистическая обработка представленыв таблице 2.5.57Таблица 2.5.

– Математическая обработка результатов измерений ииспытания воспроизводимости методикиЯМР-спектрометрПоказателиМассовое содержание сапонинов стиракса всухом экстракте, %Jeol JNM-ECA 600Jeol JNM-ECS 40029,430,1х̅-среднее массовое содержание сапониновстиракса в сухом экстракте, %29,750,494Стандартное отклонение SОтносительное стандартное отклонение Sr%Приемлемость результатов0,49429,75× 100 = 1,66Sr% ≤ 5→ удовлетворяет требованиямВышеуказанные тесты подтверждают достоверность данной методики дляколичественного определения сапонинов в сухом экстракте с помощью ЯМР-1Н.2.2.8. Исследование биологической активности БАВ и полученных отних препаратовИсследование специфической активности сапонинов околоплодниковстиракса лекарственного в опытах in silicoРазработка методов оценки безопасности и эффективности на основетехнологий биоинформатики и компьютерного конструирования лекарствсчитается одним из перспективных направлений медицинской науки.

В связи сэтим мы выбрали этот метод для предварительной характеристики сапонинов изстиракса лекарственного на этапе обоснования разработки ЛП.Использованкомплекспрограммногообеспечения,находящегосявсвободном доступе в сети Интернет. Одним из основных сайтов является базаданных PDB (Protein Data Bank), сайт, который содержит банк данных58кристаллических форм многих белков и соединений (ферменты, нуклеиновыекислоты и др.).Компьютерные программы, использованные в исследованиях1- Создание действующих химических структурных формул сапониновстиракса /Drawing the chemical structures of styrax saponinsПрограмма Marvin Sketch 17.1.23.0 (http://www.Chemaxon.com/)•2- Прогнозирование биологической активности созданных химическихструктур сапонинов стиракса / Prediction of activity for chemical structure of styraxsaponinsПрограмма PASS (Prediction of activity spectra of substances):•Использовался свободно доступный веб-ресурс PASS Online на сайтеhttp://www.way2drug.com/ для предсказания спектров биологической активностиорганических соединений на основе анализа связей структура–активность, сосредней точностью свыше 95%.Исследованиеспецифическойактивностиэкстрактовстираксалекарственного в опытах in vitroА- Изучение спермицидного действия суммы сапонинов сухогоэкстракта околоплодников стиракса лекарственногоМатериалыисследования:эякуляты, полученныеу 12мужчинснормозооспермией в возрасте около 30 лет.

Концентрацию спермиев, числоподвижных спермиев, число активно подвижных спермиев, время переживанияспермиев, рН оценивали согласно лабораторному руководству ВОЗ дляобследования и обработки спермы человека, пятое издание (WHO laboratorymanual, 2010 г.) до и после эквилибрации спермы с водными растворамисапонинов.Методика: Образцы семени сжижают при 37 °С в течение 30 минут, затемсперму анализируют с помощью цитоморфологического метода в камере Maklerдля подсчета сперматозоидов (Jiangsu Joymed TechCo., Шанхай, Китай) насветовом микроскопе при ×200.

В основании камеры имеется отверстие с59прозрачным стеклянным диском внутри, на 10 микрон ниже поверхностипластины. Когда верхняя часть устройства покрыта покровным стеклом, камера спостоянной глубиной 10 микрон готова. К измерениям Камера Makler имеетглубину 0,01 мм. Площадь сетки в центре покровного стекла составляет 1 × 1 мми делится на 100 меньших квадратов, каждый из которых составляет 0,1×0,1 мм.5 мкл спермы загружают в камеру и покрывают покровным стеклом.Избыток жидкости спермы стекает вниз в зазор между донным стекляннымдиском и верхней стеклянной пластиной. Чтобы обеспечить постоянный подсчет,в каждой камере подсчитывается не менее 200 сперматозоидов.Количество сперматозоидов определяется путем подсчета клеток в 10 илиболее квадратах в разных областях сетки, а затем вычисляют среднее значение;это значение затем умножают на 100 000, чтобы получить концентрацию вмиллион на мл единицы (м/мл).Принятые для исследования образцысоответствовуют значениямнормального эякулята в последнем ВОЗ рекомендации (1-10-2011) (Таб.

2.6.).Таблица 2.6. – Показатели нормального эякулятаПоказательЗначение1.Объем эякулята, мл2.Общее количество спермиев.< 40 ×1063.Концентрация спермиев, м/мл< 204.Число подвижных спермиев, %< 435.Число активно подвижных спермиев, %<326.Живые сперматозоиды, %< 587.рН спермы< 7,2< 1,5После исследования нативных образцов спермиев, добавляют водныерастворы различных концентраций сапонинов стиракса в хлориде натрия 0,9%(физиологическом растворе).

Сперма и исследуемые растворы сапониновиспользуются в равных объемах. Оценивают результаты активности водныхрастворов сапонинов стиракса моментально после их добавления к спермам,60затем через 30 и 60 с, далее через 10, 15 и 30 мин после инкубации. В контролеиспользуют физиологический раствор (хлорида натрия 0,9%). Результатыобработали с помощью программы Statistica MS Exsel.Б - изучения антимикробной активности сухого экстрактовоколоплодников стиракса лекарственного Styrax officinalis L.в опытах in vitroИзучение бактериостатической и фунгистатической активностиЭкспериментыисследованийпроведеныФГБНУВИЛАР,влабораторииблагодариммикробиологическихзав.лабораториеймикробиологических исследований ВИЛАР, к.б.н. Фатееву Т.В.

за помощь висследованиях.При изучении бактериостатической и фунгистатической активности вопытах in vitro использовали метод двукратных серийных разведений препаратовв жидких питательных средах. Микроорганизмы:Вкачестветест-микроорганизмовиспользовалипатогенныеграмположительные бактерии Staphylococcus aureus 209-P (АТСС 6538),грамотрицательные бактерии Escherichia coli ATCC 25922, Proteus vulgaris ATCC6896 и Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027, дрожжеподобные грибы CandidaalbicansАТСС 10231 и мицелиальные грибы Microsporum canis 252. Среды:При определении бактериостатической активности исследуемых образцовиспользовалимясо-пептонныйбульон(МПБ).Приопределениифунгистатической активности ‒ жидкую среду Сабуро. Методики экспериментов:1)-Определение бактериостатической активностиС целью изучения жидких экстрактов готовят ряд опытных пробирок с 2 млсреды (МПБ).

В 1-ю пробирку добавляют 2 мл изучаемого образца экстракта,изначально разведенного 1:2, и получая таким образом исходное разведение 1:4.61Затем,путемпоследовательногоразведенияисследуемогоэкстрактавпитательной среде в 2 раза готовят ряд убывающих разведений.При изучении сухого экстракта навеску препарата около 32 мг (точнаянавеска) взвешивали на торсионных весах, переносят в стерильную пробирку истерилизуют в течение 1 часа 96% спиртом (субстанция должна быть полностьюпокрыта спиртом). Затем в эту пробирку добавляют соответствующуюпитательную среду в количестве 4,0 мл, необходимую для создания исходнойконцентрации препарата – 8000 мкг/мл. В остальные пробирки добавляют по 2мл питательной среды и затем, путем двукратных разведений, готовят рядыубывающих концентраций препарата (опытные пробирки).

Последняя пробирка счистой средой (без добавления экстракта) служит контролем. После этого всепробирки (опытные и контрольные) засевают культурами микроорганизмов.Взвеси грамположительных и грамотрицательных бактерий готовят визотоническом растворе натрия хлорида по бактериальному стандарту мутностиОСО 42-28-85-2014 (10 МЕ) (109 микробных тел/мл). Из первой пробирки,содержащей 109 микробных тел/мл, путем десятикратных разведений визотоническом растворе натрия хлорида готовят ряд убывающих концентрациймикроорганизмов: 108, 107 106, 105 , 104. Затем, в каждую опытную пробирку,вносят по 0,2 мл взвеси, содержащей 104 микробных тел/мл (рабочая микробнаянагрузка). Посевы инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 24часов.