Диссертация (Факторы, определяющие безопасность двойной антитромбоцитарной терапии после плановых чрескожных коронарных вмешательств), страница 11

Распределение значений цистатина С в плазме крови у обследованныхбольных ИБС, получающих ДАТТ после планового ЧКВ, n=177.64!Из данных, представленных на рисунке 3 видно, что распределениезначений клиренса креатинина и СКФ вычисленное с помощью формул CockroftGault (C&G), MDRD и Cre+CysC имело правильный характер.30Формула MDRD83,0±17,8 мл/мин/1,73м225Количество больных, nФормула Cre+CysС91,1±22,2 мл/мин/1,73м22015Формула C&G103,6±32,4 мл/мин/1,73м210500102030405060708090100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200Скорость клубочковой фильтрации, мл/мин/1,72м2Рисунок 3.

Распределение показателей скорости клубочковой фильтрации,рассчитанной по формулам MDRD, Cockroft-Gault (C&G) и Cre+CysC у больныхстабильной ИБС, получающих ДАТТ.Исследование коагуляционных показателей.Исследование параметров системы гемостаза проводилось в лабораторииклинических проблем атеротромбоза ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ (заведующийлабораторией – проф., д.б.н. Добровольский А.Б.).Исследование ОРТ к АДФ на терапии клопидогрелом проводили приплановом визите пациента в клинику на 6-м месяце регулярного приёмапрепарата.ИсследованиеОРТвыполнялосьсиспользованиемтурбидиметрического метода и стандартных тест-картриджей в образцахцельной венозной крови, взятой вакутейнером, содержащим в качестве65!консерванта 3,2% раствор цитрата натрия на агрегометре VerifyNowP2Y12(Accumetrics, San Diego CA USA).

Остаточная реактивность тромбоцитоввыражалась в условных единицах реактивности P2Y12 рецепторов тромбоцитов,в т.н.P2Y12 reaction units (PRU).РаспределениевеличинОРТкАДФуобследованныхбольныхприближалось к нормальному. Среднее значение ОРТ составило 174,1 ± 62,9PRU (минимум - 6 PRU, максимум - 306 PRU) (рисунок 4).2422Среднее = 174,1 ± 62,9 PRUКоличество больных, n201816Медиана 187,0 PRU14121086420020406080 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320Остаточная реактивность тромбоцитов к АДФ (PRU)Рисунок 4. Вариабельность остаточной реактивности тромбоцитов к АДФ убольных стабильной ИБС, получающих ДАТТ, n=115.Исследованиемаркеровактивациифибринолиза(Д-димер,ИАП-1,комплексов ПАП, ТАП-ИАП-1) проведено у 177 больных, уровень фибриногенаизмерен у 111 пациентов. Характеристика коагуляционных показателейпредставлена в таблице 6.Определение уровней фибриногена проводилось по методу Клаусса сиспользованием набора реактивов STA-Fg (Diagnostica Stago, Франция).66!Таблица 6Коагуляционные показатели у больных стабильной ИБС, получающихДАТТКоличествоПоказательМедиана (24-й,n75-й квартиль),Mср ± SDМе (Qн; Qв)Нормальнбольных соыйзначениямидиапазон*показателя впоказателпределахянормальногодиапазона*, n (%)Д-димер,нг/мл177412,1 (254,3; 647,7)582,3 ± 548,3< 400 нг/млn=85, (48,0%)177270,1 (172,5; 342,9)323,3 ± 442,3< 514 нг/млn=166, (93,8%)17716,7 (13,9; 20,7)18,4 ± 8,27 - 20 нг/млn=125, (70,6%)17714,0 (6,2; 22,1)16,2 ± 14,01 - 7 МЕ/млn=49, (27,7%)1113,5 (3,1; 3,9)3,5 ± 0,72 - 4 г/лn=88, (79,3%)КомплексПАП,нг/млКомплексТАПИАП-1,нг/млИАП-1,МЕ/млФибриноген, г/лПримечание: * - указанный производителем набора для определения показателяКак показано на рисунке 5, распределение значений фибриногенаприближалось к нормальному.

Среднее значение составило 3,5 ± 0,7 г/л. Убольшинства (79,3%) больных содержание фибриногена находилось в пределахнормального распределения показателя (2 – 4 г/л), как показано в таблице 6.67!24Референсные значения 2 - 4г/л n=88, (79,3%)22Количество больных, n2018Среднее знечение 3,5 ± 0,7 г/л1614Медиана 3,5 (3,1; 3,9)12108647,06,56,05,55,04,54,03,53,02,52,01,51,00,000,52Фибриноген, г/лКвинтилиQ1Q2Q3Q4Q51,8 - 3,03,1 - 3,43,5 - 3,63,7 - 4,04,1 - 6,2распределенияФибриноген, г/лРисунок 5. Распределение содержания фибриногена у больных стабильной ИБС,получающих ДАТТ, n=177.ОпределениеуровняД-димерапроводилосьметодомИФАсиспользованием набора Asserachrom D-Di, производства Diagnostica Stago(Франция).Связывающиеантитела-F(ab')2фрагментымышиныхмоноклональных антител (2F7) к Д-димеру человека, проявляющие - кроличьиантитела к фрагменту Д фибриногена человека, меченные пероксидазой.Распределение Д-димера было резко скошено влево (рисунок 6).

Медианазначений Д-димера составила 412,1 нг/мл (минимум – 102,1 нг/мл; максимум –3880,3 нг/мл). Превышение нормы, указанной производителем было отмечено у52% больных (таблица 6).68!70Медиана 412,1 (254,3; 647,7)Количество больных, n6050Норма < 400 нг/мл, n=85 (48,0%)4030Среднее знечение 582,3 ± 548,3 нг/мл2010400038003600340032003000280026002400220020001800160014001200100080060040020000Д-димер, нг/млКвинтилираспределенияД-димер, нг/млQ1Q2Q3Q4Q5≤236,1236,2 - 315,6315,7 - 497,2497,3 - 783,5783,6 - 3880,4Рисунок.

6. Распределение содержания Д-Димера у больных стабильной ИБС,получающих ДАТТ, n=177.Определение уровня ИАП-1 проводилось методом ИФА с использованиемнабора Technozym PAI-1 Actibind ELIZA, производства Technoclone (Австрия).Для связывания ингибитора используется иммобилизованный на плашке ТАП,для проявления моноклональные антитела к ИАП-1, меченые пероксидазой.Как показано на рисунке 7 распределение ИАП-1 носило неправильныйхарактер и было резко скошено влево. Медиана для ИАП-1 составила 14,0МЕ/мл, интерквартильный размах 6,2 МЕ/мл – 22,1 МЕ/мл. Более чем уполовины (72,3%) больных значения ИАП-1 превышали верхний пределраспределения показателя (таблица 6).69!35Медиана 14,0 (6,2; 22,1)Количество больных, n3025Норма 1-7 МЕ/мл, n=49 (27,7%)2015Среднее знечение 16,2 ± 14,0 МЕ/мл108075706560555045403530252015105005Ингибитор активатора плазминогена 1 типа, МЕ/млКвинтили распределенияQ1Q2Q3Q4Q5ИАП-1, нг/мл0,2 – 4,84,9 – 9,59,6 – 15,515,6 – 23,823,9 – 70,0Рисунок 7.

Распределение активности ИАП-1 у больных стабильной ИБС,получающих ДАТТ, n=177.Комплекс ПАП определяли с использованием набора PAP Complex ELIZAметодом ИФА, производства Technoclone (Австрия). Для связывания комплексаиспользовались моноклональные антитела, взаимодействующие с неоантигеномПАП, для проявления антитела к плазминогену, меченные пероксидазой.Распределение ПАП было резко скошено влево (рисунок 8). Медиана длякомплекса ПАП составила 270,1 (172,5; 342,9) нг/мл.

У большинства больныхсодержание комплекса ПАП находилось в пределах нормы, указаннойпроизводителем: 93,8% (таблица 6).70!70Количество больных, n60Медиана 270,1 (172,5; 342,9)5040Норма 0-514 нг/мл, n=166 (93,8%)30Среднее знечение 323,3 ± 442,3 нг/мл204400420040003800360034003200300028002600240022002000180016001400120010008006004000020010Комплекс плазмин-α2-антиплазмин, нг/млКвинтилираспределенияПАП, нг/млQ1Q2Q326,7 - 146,7 146,8 - 242,3 242,3 - 306,4Q4Q5306,5 -3 66,8366,9 - 4340,1Рисунок 8. Распределение комплекса ПАП у больных стабильной ИБС,получающих ДАТТ (n=177).Комплекс ТАП-ИАП-1 - определяли с использованием набора t- PA/PAI-1Complex ELIZA, производства Technoclone (Австрия) методом ИФА. Длясвязывания комплекса используются моноклональные антитела к ТАП человека,для проявления моноклональные антитела к ИАП-1, меченные пероксидазой.Распределение ТАП-ИАП-1 было резко скошено влево, как показано нарисунке 9. Медиана для комплекса ТАП-ИАП-1 составила 16,7 (13,9; 20,7) нг/мл.У большинства больных содержание комплекса ТАП-ИАП-1 находилось впределах нормы, указанной производителем и составило 70,6% соответственно(таблица 6).71!60Медиана 16,7 (13,9; 20,7)Количество больных, n5040Норма 7 - 20 нг/мл, n=125 (70,6%)3020Среднее знечение 18,4 ± 8,2 нг/мл109085807570656055504540353025201510500Комплекс тканевой активатор - ингибитор активатораплазминогена 1 типа, нг/млКвинтили распределенияQ1Q2Q3Q4Q5ТАП-ИАП-1, нг/мл7,1–14,614,7–15,615,7–18,518,5–21,921,9–82,7Рисунок 9.

Распределение комплексов ТАП-ИАП-1 у больных стабильной ИБС,получающих ДАТТ (n=177).Генетические методы исследования.Исследованиеполиморфизмовгенов,связанныхсовсасываниемклопидогрела в кишечнике (ABCB1 С3435T) и его метаболизмом в печени(CYP2C19 (*1,*2,*3,*17)) проводилось на базе ЗАО «НПФ ДНК-Технология»методами, основанными на аллель-специфичной полимеразной цепной реакции(ПЦР).

Выделение геномной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) извенозной крови проводилось с использованием комплекта реагентов «ПРОБАГС-ГЕНЕТИКА» (ДНК-Технология), согласно инструкции.Определение замен одиночных нуклеотидов ABCB1: 3435 С>T (Ile1145Ile),CYP2C19: 681 G>A *2 (Pro227Pro), CYP2C19: 636 G>A *3 (Trp212X), CYP2C19:-806 C>T *17 проводили методом «примыкающих проб» (adjacent probes, kissingprobes) [111, 112].72!При идентификации замен одиночных нуклеотидов вначале проводилиПЦР с праймерами, общими для обоих вариантов последовательности, затемпонижали температуру реакционной смеси для гибридизации полученнойматрицы с олигонуклеотидными пробами.

Определение генотипа проводилипосле ПЦР и гибридизации путем измерения уровня флуоресценции в ходетемпературной денатурации дуплексов олигонуклеотидов и полученных матриц.Исследование проводилось в режиме реального времени.Условия реакции подбирали так, чтобы максимизировать разницу втемпературах плавления совершенного и несовершенного дуплексов. Такимобразом,еслианализируемыйпоследовательности,т.е.былобразецсодержалгомозиготенпотолькоданномуодинвариантполиморфизму,температура плавления для пробы образующей совершенный дуплекс быласущественно выше, нежели для пробы образующей несовершенный дуплекс.Если же анализировали гетерозиготный образец, температуры плавления былипрактически одинаковы.ПЦР и определение температуры плавления олигонуклеотидных пробпроводили на амплификаторе ДТпрайм (ЗАО «НПФ ДНК-Технология», Россия).Состав буфера для проведения ПЦР: 74 мМ Трис-HCl рН 8,6, 15 мМ (NH4)2SO4,1,5 мМ MgCl2,0,0003% Tween-20, 0,0003% NP-40, 6,25% глицерин.Использовали следующий температурный режим амплификации: 94˚С – 10 с,64˚С – 30 с в течение 50 циклов.

После завершении амплификации реакционнуюсмесь остужали до 25˚С со скоростью 2˚С/сек. Кривые плавления получалиследующим образом: температуру реакционной смеси повышали с 25˚С до 75˚Сс шагом 1˚С, измеряя уровень флуоресценции на каждом шаге.Для предотвращения неспецифического отжига праймеров и повышениячувствительности тест-систем использовали Taq-полимеразу блокированнуюспецифическимиантителами.КомплексTaq-полимеразыиантителдиссоциировал при температуре около 65˚С, т.е. реакция амплификациистартовала в условиях благоприятных для специфического отжига праймеров.73!При проведении генотипирования с применением разработанных тестсистем, для повышения достоверности полученных результатов, все образцыДНК тестировали в двух повторах.При проверке работоспособности созданных тест-систем, в качествереференсногометодаопределениягенотипаобразцовиспользовалиавтоматическое секвенирование ДНК по Сэнгеру.

Секвенирование проводили наавтоматическом секвенаторе ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer (AppliedBiosystems, США) используя реактивы и рекомендации производителя.Секвенировали по пять образцов каждого генотипа по всем исследуемымполиморфизмам, определяя генотипы с помощью разработанных тест-систем.Программное обеспечение, использованное в работе:-!Oligo.Позволяетподбиратьпраймерыкнуклеотиднымпоследовательностям, а также рассчитывать приблизительную температуруотжига праймеров.-!Chromas. Позволяет переводить в текстовый формат хроматограмы,полученные в результате секвенирования.Исследование полиморфных вариантов генов, кодирующих активностьцитохромар450CYP2C19(*1,*2,*3,*17)проведеноу185больных.Носительство аллелей ослабленного метаболизма фермента, метаболизирующегоклопидогрел, CYP2C19*1/*2 и *2/*2 выявлено соответственно у 20,5 % и 1,6%больных.