Диссертация (Разработка способа получения субстанции антимикробного действия на основе ройлеанонов из корней шалфея лекарственного), страница 7

Последнее веществообладает высокой антимикробной активностью в отношении болезнетворныхмикроорганизмов полости рта.В нашей работе наибольшее значение имеет антимикробная активностьтритерпеноидов, производных олеанана и урсана, как сопутствующихвеществ в субстанции антимикробного действия «Ройлевин». Суммируявышеизложенное, можно отметитьоднонаправленность активности двухразных групп природных соединений – хиноидных дитерпенов абиетановогоряда (ройлеанонов) и пентациклических тритерпенов. Таким образом, приразработке технологии получения антимикробного препарата из корнейшалфея лекарственного на основе ройлеанонов следовало рассматриватьпроизводные олеанана и урсана разной степени окисленности как весьмажелательные компоненты в субстанции.

Применяемая нами технологиядостигла этой цели.43ЧАСТЬ II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬГлава II.ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯОбъекты исследования. Объектами для исследования служили корнишалфея лекарственного (Salvia officinalis L., сем. Яснотковые), культивируемые врайоне станицы Васюринской, Краснодарского края после использованиярастений для заготовки листьев в течение нескольких вегетационных периодов.Корни предназначались для ликвидации перед возобновлением на даннойплощади новой плантации.Для изучения химического состава использовали корни 6-7 летнеговозраста, собранные в ноябре 2012 г.

и 3х летнего возраста, собранные в ноябре2013г. Для лабораторного регламента использовали корни 3х летнего возраста(2013 г.).Измельчение сырья проводили на экспериментальном измельчителерастительного материала МИР-1 (Россия). Номинальная частота вращения 3000об/мин. Производительность 40 кг/ч.Материалы и методы исследования. Отбор проб и анализ растительногосырья производили по методике ГФ XIII, т.1, ОФС.1.10005.15 и разработанныминами методиками количественного определения ройлеанонов. Качественныйанализ (подлинность) осуществляли предложенным нами способом: ройлеаноны– реакция окрашивания раствора в фиолетово-сиреневый цвет при добавленииводного раствора аммиака или гидроксида натрия, данные 1Н ЯМР спектра, УФспектра и масс-спектра, ТСХ-, ВЭЖХ-хроматограммы, тритерпеноиды – поположительному результату реакции Либермана-Бурхарда[117].Микроскопический анализ сырья.

Анализ цельного сырья проводилисогласно статье«Техника микроскопического анализа» ГФ XIII, т.2,ОФС.1.5.3.0003.15[17] с помощью биологического микроскопа «Альтами БИО 2LED» с цифровой насадкой фирмой ООО «Альтами» (Россия). Фотографиибыли обработаны на компьютере в программе «AdobePhotoshop 7.0».44Для экстракции БАВ, колоночной и тонкослойной хроматографиииспользовали растворители и реактивы марки «ч» и «хч»:-вода очищенная (ФС 2.2.00.15);-спирт этиловый ректификованный (ГОСТ 5962-2013 Спирт этиловыйректификованный из пищевого сырья);-хлороформ (ГОСТ 20015-88.

Хлороформ);-кислота соляная (ГОСТ 3118-77. Реактивы. Кислота соляная);-метанол-яд (ГОСТ 6995-77. Реактивы. Метанол-яд);-ангидрид уксусный (ГОСТ 5815-77. Реактивы. Ангидрид уксусный);-кислота серная (ГОСТ 4204-77. Реактивы. Кислота серная) ;-ванилин (16599-71. Ванилин);-силикагель 40/100µ для хроматографии, Chemapol, Praha;-пластинки для тонкослойной хроматографии «Silufol UV 254» 20х20 см, 15х15см, 6х15 см, Kavalier, Czechoslovakia.Приготовление реактивов, используемых в экспериментальной частиосуществляли согласно ГФ XIII, т.1, ОФС.1.3.001.15 [16].Концентрирование извлечений и упаривание растворителей осуществлялив вакуум выпарном ротационном испарителе IKARV 10 (Германия).Тонкослойнаяхроматография(ТСХ).ТСХиспользоваласьдляпредварительной оценки экстрактов, для оценки элюатов в ходе колоночнойхроматографии, для оценки чистоты индивидуальных веществ и для сравненияисследуемых веществ с аутентичными образцами, выделенными ранее в ВИЛАРРомановой А.С.

с сотр (1972-73гг.) [42,44]. Хроматографирование проводили вгерметически закрытых вертикальных стеклянных камерах. Исследуемыерастворы наносили на хроматографические пластинки при помощи стеклянныхкапилляров и стеклянной пипетки. Исследования проводили согласно ГФ XIII,т.1, ОФС.1.2.1.2.0003.15.Для тонкослойной хроматографии использовали систему растворителей:хлороформ 100%, хлороформ-метанол 8:2, 9:1, 95:5, хлороформ-метанол-вода61:32:6. Проявление зон адсорбции проводили просматривая пластинки UV-25445под ультрафиолетовой лампой SPECTROLINEmodelENF-240C/FE, 230 volts, 50HZ, 0,17 AMPS (США) (254 нм и 365 нм) и затем обрабатывая парами аммиака(ройлеаноны). Наличие веществ неройлеанонового характера, в частноститритерпеноидов, фиксировали проявлением пластинки 5% спиртовым растворомфосфорно-молибденовой кислоты с последующим нагреванием при температуре100оС±2оС в течение 2-3 минути окрашиванию зон адсорбции в светло-голубойцвет под действием реактива ванилин-серная кислота[117].ВЭЖХ-хроматограммы получены при следующих условиях: хроматографAgilent 1100 Series с диодной матрицей (США), колонка Halo C-18 (150x4.6 мм,2.7 мкм, элюент 1% ТЭА, 100% ацетонитрил, градиент от 5 % до 100 %ацетонитрила за 1 час).

Температура термостата колонки 20оС, УФ 280 нм.Записьрезультатов проводится согласно ГФ XIII, т.1, ОФС.1.2.1.2.0005.15 [16].Спектры 1Н ЯМР получены на спектрометре Gemini 200 (Великобритания)с рабочей частотой 200 МГц, растворители CDCl3, CD3OD, О-ТМС.Приготовление образца для записи 1Н ЯМР спектра: 5-6 мг ройлеанона и 10-12мг тритерпеноида растворяют в соответствующем дейтеро-растворителе.

Записьспектра осуществляют согласно ГФ XIII, т.1, ОФС.1.2.1.1.0007.15 [16].УФ-спектры регистрировались на приборе CARY 100 SCAN (Австралия) сдиапазоном длин волн от 200 до 800 нм. Растворитель - 96% этанол.Концентрация порядка 0,001%. Записи спектра производится согласно ГФ XIII,т.1, ОФС.1.2.1.1.0003.15 [16].Масс-спектры получены на приборе JMS GCmate II (JEOL, Япония) врежиме прямого ввода. Регистрация масс-спектров: энергия ионизации 70 эВ,температура источника 200 0С, температурный диапазон 100-300 0С соскоростью нагрева 100 0С/мин, сканирование в диапазоне 10-600 Да соскоростью 1 скан/с (для терпеноидов).

Запись результатов проводится согласноГФ XIII, т.1, ОФС.1.2.1.1.0008.15 [16].46Глава III. ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГО-АНАТОМИЧЕСКИХХАРАКТЕРИСТИК И ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА КОРНЕЙШАЛФЕЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО (SALVIA OFFICINALIS L.)3.1.Ройлеаноны3.1.1.Изучение морфолого-анатомического строения корней шалфеялекарственногоСырье корневищ с корнями шалфея лекарственного представляет собоймногоглавый стержневой деревянистый главный корень темно-бурого цветас многочисленными придаточными мочковатыми корнями (Рисунок 9).Главный корень слегка извитой, длина главного корня – 10-20 см,придаточные корни длиной до 15-20 см. Диаметр главного корня у основаниясоставляет 2-3 см, постепенно сужаясь до 1-0,5 см.

Ломается легко, на изломекорневища бело-кремового цвета.Морфолого-анатомическиелекарственногонеспецифичныхарактеристикиидлякорнейопределенияшалфеядиагностическихпризнаков сырья следует использовать микроскопический анализ.Рисунок 9. Корневища шалфея лекарственного.3.1.2.

Микроскопический анализ сырьяПри рассмотрении поперечного среза видна крупноклеточная легкошелушащаяся пробка. Клетки коры под пробкой, крупные, тангентально-47вытянутые, другие более мелкие, расположенные радиальными рядами.Клетки коры и сердцевинных лучей содержат оранжевые или сероватооранжевые включения. Они служат местом локализации ройлеанонов. В коревстречаются одиночные или небольшими группами клетки-идиобласты, вполости которых находятся призматические кристаллы оксалата кальция.Древесинакорняимеетмногочисленныеодно-двух,режетрех-четырехрядные сердцевинные лучи, четко выраженные годичные кольца.Сосуды древесины с окаймленными порами лежат одиночно, изредка по 2-3,встречаются трахеиды, волокна либриформа и клетки древесной паренхимы,расположенные продольными рядами вблизи крупных сосудов.

Все элементыдревесины и клетки сердцевинных лучей сильно одревесневшие.Рисунок 10. Поперечный срез корня Рисунок 11. Фрагмент поперечногочерез кору (I-пробка, 2-парехима коры, среза корня через флоэму (ув. 400х).3-кристаллы оксалата кальция) (ув.90х).Рисунок 12.Фрагмент поперечного Рисунок 13. Фрагмент продольногосреза через флоэму (I-идиобласты с среза коры корня через одностороннекрист. оксалата кальция) (ув.

400х).утолщенные идиобласты (ув. 400х).48Рисунок 14. Поперечный срез корня Рисунок 15. Фрагмент поперечногочерез древесину (I-сосуды ксилемы, 2- среза древесины (ув.200х).либриформ,3-сердцевинныйлуч)(ув.90х).Рисунок 16. Фрагмент продольного Рисунок 16 а. Фрагмент поперечногосреза древесины (I-сосуды ксилемы, 2- тангентального среза через древесинулибриформ) (ув.400х).корня (ув. 200х).НаРисунке10видныотдельныеидиобласты с кристаллами оксалата кальция.односторонне-утолщенныеНа Рисунке 11 видныодносторонне-утолщенные идиобласты с кристаллами оксалата кальция (I); вклетках флоэмы – оранжевые зернистые включения (2). На Рисунке 12 видныширокие ситовидные трубки, сердцевинный луч и зернистые включенияоранжевогоцветавклеткахфлоэмы(2).НаРисунке13виднымногочисленные призматические кристаллы оксалата кальция (I) и толстыеслоистые оболочки клеток.

На Рисунке 14 видны годичные кольца49древесины. На Рисунке 15 видны сосуды (I), трахеиды, либриформ (2),древесная паренхима, 1-3-рядные сердцевинные лучи (3). На Рисунке 16видны пористые оболочки клеток сердцевинных лучей (3). На Рисунке 16 авидны сердцевинные лучи (3), либриформ (2) и проводящие элементыксилемы (I).3.1.3.Экстракция сырья. Выделение ройлеанонов методом колоночнойхроматографииИзмельченные корни шалфея лекарственного (250,0 г) триждыэкстрагировали хлороформом 1:5. Объединенные экстракты упаривали,остаток (4,15 г) растворяли в ацетоне, раствор профильтровывали, фильтратупаривали. Полученный продукт (3,89 г) хроматографировали на колонке ссиликагелем 40/100μ (d=2,5 см, h=37,5 см), предварительно смешав его с темже силикагелем 1:4. Элюирование проводили хлороформом.