Диссертация (Теоретические и методологические подходы к стандартизации и оценке качества лекарственного растительного сырья и масляных экстрактов на его основе), страница 7

Для рутина предложено йодхлорометрическое определение. Титриметрические методы экономичны,быстры в исполнении, но недостаточно точны и дают завышенные результаты. С их помощьюможно определить только сумму флавоноидов.29Таким образом, рассмотрение вопросов качественного и количественного анализа флавоноидных соединений в сравнительном аспекте с одновременной характеристикой возможностей каждого из рассматриваемых методов и областей их наиболее возможного применения вфармацевтическом анализе показывает, что для анализа флавоноидов в многокомпонентныхпрепаратах наиболее целесообразно использовать селективный и универсальный метод ВЭЖХ.В отдельных случаях возможно применение методов ТСХ, дифференциальной спектрофотометрии и флуориметрии.1.1.1.3.Дубильные веществаПо классификации Г. Проктера (1894) дубильные вещества (ДВ) в зависимости от природы продуктов их разложения при температуре 180-200 °С (без доступа воздуха) ДВ разделяются на две основные группы (таблица 13).Таблица 13Классификация ДВ по Г.

Проктеру [144]Нагревание доДействие раствором солейРазновидность ДВ180-200°Сокисного железаЧерно-синееПирогалловая группаВыделяется пиррогалолокрашиваниеПирокатехиноваяЧерно-зеленоеВыделяется пирокатехингруппаокрашиваниеНаиболее часто в настоящее время используют классификацию Фрейденберга, который в1993 году уточнил классификацию Проктера и выделил 2 основных группы ДВ:1) Гидролизуемые ДВ: а) галлотанины - эфиры сахаров и галловой кислоты; б) различные эфиры фенолкарбоновых кислот; в) эллаготанины - эфиры сахаров и эллаговой кислоты.2) Конденсированные ДВ: а) производные различных флаванолов; б) производные различных флавандиолов; в) производные оксистильбенов.Чаще всего в растениях встречается смесь гидролизуемых и конденсированных ДВ, спреобладанием соединений той или иной группы (дуб черешчатый, змеевик, кровохлебка, бадан толстолистный, лапчатка прямостоячая) [144].Методы определения ДВДВ легко извлекаются водой и водно-спиртовыми смесями.

Для качественного определения ДВ в ЛРС ГФ XIII [93] предлагает использовать реакцию с раствором железоамониевых квасцов с образованием черно-синего или черно-зеленого окрашивания. Основные качественные реакции, описанные в литературе, обобщены в таблице 14. Для качественногоопределения ДВ в сырье, согласно требованиям ЕФ [400-403], используется ТСХ, а для коры30дуба – цветная реакция с раствором ванилина в серной кислоте (наблюдается красное окрашивание) [97,98,372].Таблица 14Основные качественные реакции ДВ [144]№п/п1Название реакции2Методика проведенияЭффект реакции34Осадочные реакцииК 1 – 3 мл извлечения добавляют 2-3 каплиБелый осадок или по1С желатином1% раствора желатина в 10% раствор натриямутнение растворахлоридаК 1 – 3 мл извлечения добавляют 2-3 каплиС солями алкалоиОсадок или наблюдает21% раствора солей хинина или другого алкадовся помутнение растворалоидаПотемнение раствораК 1 – 3 мл извлечения добавляют 3 – 5 ка3 С калия бихроматомили выпадение желтопель 5% раствора калия бихроматакоричневого осадкаС основным ацета- К 2 – 3 мл извлечения добавляют раствор4Выпадение осадкатом свинцаосновного ацетата свинцаЦветные реакцииК 3 мл извлечения добавляют 3-5 капельОбразование вольС реактивом Фоли- реактива Фолина-Дениса и небольшое ко5фрамовой или молибна-Денисаличество кристаллического натрия карбоденовой сининатаОбнаружение ДВ при совместном присутствии обеих группГидролизуемые ДВ черно-синее окрашиС солями железаК 1 – 3 мл извлечения добавляют 3 капли6вание, конденсиро(III)1% раствора железоаммоний ных квасцовванные – чернозеленоеКонденсированные ДВ желто-оранжевый осаК 5мл извлечения добавляют несколькодок, гидролизуемые 7С бромной водой капель бромной воды и жидкость доводятвыпадают в осадокдо кипениятолько при добавленииизбытка бромной водыК 1 мл извлечения добавляют 2 мл 10% ук- Гидролизуемые ДВ –сусной кислоты и I мл 10% раствора свинца осадок, конденсированС ацетатом свинцаацетата среднего.

Осадок отфильтровывают ные - окрашивание8 средним в уксуснойи к фильтрату добавляют 10 капель 1% рас- фильтрата вокруг крисредетвора железоаммониевых квасцов и несколь- сталлов в черно-зеленыйко кристалликов натрия ацетатацветС нитритомК 2 мл извлечения прибавляют несколькоГидролизуемые ДВ 9натрия в кислойкристалликов натрия нитрита и 0,5 мл хло- кармино-красное окрасредеристоводородной кислотышивание растворС раствором вани- На стекло наносят 2 – 3 капли извлечения и Конденсированные ДВ10лина в кислойприбавляют несколько капель раствора ва- красное окрашиваниесреденилина в кислой средераствораРеакцияК 25 мл извлечения прибавляют 5 мл 40% Конденсированные ДВ 11раствора формальдегида и 3 мл конц.

HCL.осадок кирпично-3112Стиасни34Смесь кипятят 30 минут в колбе с обратнымкрасного цвета гидролихолодильником. После охлаждения осадокзуемые - синеотфильтровывают; к 10 мл фильтрата добавфиолетовое окрашиваляют 1 мл 1% раствора железоаммониевыхние около кристалловквасцов и несколько кристалликов натриянатрия ацетатаацетатаОпубликованы данные о 100 различных способах количественного определения ДВ, которые можно разделить на несколько групп.Хроматографические методыПрименение метода ВЭЖХ для анализа ДВ является наиболее оптимальным, так как метод позволяет одновременно провести идентификацию соединений и количественно определить их в исходном растительном сырье и препаратах. Метод ВЭЖХ включен в НД для количественного определения танина в семенах сосны кедровой, в монографиях фармакопеи СШАна ЛРС, содержащее танины [431,432].

Сведения об использовании метода ВЭЖХ в анализеДВ в ЛРС и ФП обобщены в таблице 15.Таблица 15Варианты использования метода ВЭЖХ в анализе ДВ в ЛРС и ФП [97,98, 211,416,417,433]№ЛРС/ФППробоподготовкаЭлюентДетекцияп/п123451Корневища и корни, Экстракция 40% этило- ацетонитрил-водаУФ- свет прижидкий экстракт ивым спиртомледяная уксуснаядлине волнысироп кровохлебкикислота (4:6:0,1)280 нмлекарственной2Лапчатка прямостоя- Экстракция 70% этилометанол-водаУФ-свет причая, корневища свым спиртомфосфорная кислотадлине волныкорнями сабельника(40:60:5)254 нмболотного3Корневища с корнямиацетонитрил - 0,1%УФ-свет присабельника болотногофосфорная кислотадлине волны(15:85)280 нм4Галлотанины турец- Экстракция смесьюУФ - свет приких галлов и листьев тетрагидрофуран - медлине волнысумахатанол безводный- ледя280 нмная уксусная кислота(20:80:0,8)5Кора дубаЭкстракция смесью2 растворителя:УФ-свет приметилового спирта ираствор А:водадлине волныволы (1:1), после чегофосфорная кислота150, 280 иего фракционируют(999:1) и раствор360 нмжидкость-жидкостнойБ:метанолэкстракцией диэтилофосфорная кислотавым эфиром и этилаце(999:1)татом32162Древесина дуба,плоды ежевики34Выделение ацетоново- метанол (раствор А)водными смесями, ме- и 0,2% водный растанолиз проводят рас- твор трифторуксуствором хлористоводоной кислоты (расродной кислоты в метатвор Б)ноле безводном5УФ-свет придлине волны252 и 280 нмОсновные сведения о способах и приемах ТСХ, описанные в литературе, используемыедля анализа ДВ, приведены в таблицах 16 и 17.Таблица 16Основные элюенты, используемые для идентификации и разделения ДВ, методом ТСХ [97,98]№ п/пЭлюентСосотав1ЭЭ – У – Г – Э20:20:20:402МК – Э – Т10:30:603Б–У–В4:1:24Э – МК – В80:10:105Х – В – Эт60:30:206Э–Т2:987МК – УК – В – Э7,5:7,5:18:678МК– В – Э8:8:849Б – МК – В65:16:1910Б–У–В4:1:511Б–У–В4:1:1Э – этилацетат; У – ледяная уксусная кислота; В – вода; Х – хлороформ; Г – гексан; Б – бутанол; Т – толуол; Эт – этанол; МК – муравьиная кислота; ЭЭ - этиловый эфирТаблица 17Детектирующие реагенты, используемые для проявления ДВ, методом ТСХ№ п/пДВДетекторующий реагентРезультат1Танин, галовая кисХлорид железа (III)Серо-синие зонылота2ХризантеминПри дневном светеФиолетовые зоны3КатехинFast blue B salt, пары аммиакаКрасно-коричневыйзоны4Кофейная и хлоро- Аминоэтиловый эфир дифенилбор- Зоны с красной, синей,геновая кислотыной кислоты в метаноле и макрогол зеленой и желтой флю400 в метаноле, УФ 365 нморесцентцией5Рутин, изокверцит- Аминоэтиловый эфир дифенилборЗоны с оранжевойрозидной кислоты в метаноле и макроголфлюоресцентцией400 в метаноле, УФ 365 нм6Хлорогеновая кис- Аминоэтиловый эфир дифенилбор- Зоны с зеленой и желлота, гиперозид, ру- ной кислоты в метаноле и макрогол той флюоресцентциейтин400 в метаноле, УФ 365 нм7Танин, галовая кис- Квасцов железоаммониевых растворСеро-синие зонылота1%8Танин, галовая кис- Ванилина раствором в хлористовоКрасные зонылотадородной кислоте 2%9Полифенольные со- Алюминия хлорида спиртовым расЖелтые зоныединениятвором 2%33В литературе, в работах Самылиной И.А.

и Гринько Е.Н., приведены результаты ТСХхарактеристик подлинности ЛРС, содержащего ДВ [97,98].Описан способ идентификации и количественного денситометрического определения галловой кислоты методом ТСХ в траве лофанта анисового [372], включающийполучение извлечения с использованием 70% этилового спирта с последующим хроматографированием на пластинках марки «Sorbfil ПТСХ-АФ-А-УФ» в системе н-бутанол - ледянаяуксусная кислота - вода ( 4 : 1 : 1 ) при подъеме фронта растворителя на 12 см; высушивание пластин на воздухе до исчезновения запаха растворителя, обработку 1% водным раствором железоаммониевых квасцов, сканирование пластинки с помощью планшетного сканера с разрешением 100 dpi; обработку хроматограмм компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer» [105,106,372].Недостатком данного способа является невозможность одновременного определениядругих представителей группы ДВ в растительных объектах и многокомпонентных лекарственных формах без предварительного разделения на отдельные компоненты.Гравиметрические методыОснованы на способности ДВ количественно осаждаться желатином, солями тяжелыхметаллов или обезжиренным кожным порошком.

В литературных источниках также имеютсяданные о возможности применения казеина вместо кожного порошка в методике количественного определения ДВ [242].Титриметрические методыПерманганатометрическое титрование - метод Левенталя, включенный в ГФ XIII издания, измененный А.Л. Курсановым, основан на способности ДВ к окислению в среде, подкисленной серной кислотой при добавлении индигосульфокислоты в качестве индикатора [6]. Согласно методу ГФ XIII, в процессе анализа сырье подвергается однократной экстракции, подобно способу получения отвара. Это дает возможность определить количество ДВ, которые больные употребляют при приеме отвара из ЛРС данного вида.

Этот метод включен во все отечественные НД на ЛРС, содержащее ДВ [242]. Однако, метод имеет большое количество недостатков, таких как завышенность результатов определений (наряду с дубильными веществамипроисходит окисление и других групп БАВ); неприемлемость применения единого пересчетного коэффициента для растительного сырья, содержащего танино-катехиновую смесь (показано,что в зависимости от исследуемых объектов он может составлять от 0,00416 до 0,00735).