Диссертация (1139719), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Хроматография на бумаге (таблица 7) до сих пор остается наиболее широко используемым приемом при анализе флавоноидных соединений [133,215].Таблица 7Подвижные фазы для бумажной хроматографии [2,133,215,278]№ п/пПодвижная фазаСоотношение, v/v12345678У – HCl – ВИА – HCl – ВБ–У–ВБн – У – ВХ – М - МЭТ–У–ВА–П–У–ВБн – Э – У5:1:5, 30:3:10, 15:3:825:1:14:1:5, 40:12:28, 6:1:2125:72:39:4:24:1:53:2:2:170:30:2Э – этилацетат; У – ледяная уксусная кислота; В – вода; М - метанол; Х – хлороформ; Б – бутанол; Т –толуол; Бн – бензол; А – амиловый спирт; ИА – изоамиловый спирт; П – пропанол; МЭ - метилэтилкетонВ таблице 8 указаны проявители наиболее часто используемые при хроматографировании отдельных групп флавоноидов.Для разделения фенольных соединений наиболее широко используются следующие сорта хроматографической бумаги: «хроматографическая медленная», Ватман № 1, 2 и 3ММ,Шлейхер и Шюлль 2043 и японская бумага Тойо №50.25Таблица 8Проявители, применяемые при бумажной хроматографии флавоноидов [2,133,215,278]РеактивКонцентрацияСоединения, которые даютокраскуАммиакПарыВсе эуфлавоноиды (за исключением АЦ)NaOH1-5 % водн.
р-рТе же и антоцианидиныH3BO3 + лимонная кислота в 0,5 г кислоты в 20 мл безв.5-окси- и метоксизамещенныеметаноле (реактив ВильсоСН3ОНфлавоны, флавонолы и халконына)Н3ВО3 + уксусный ангидрид Насыщенный р-р борной5-окси- и мнтоксизамещенные(реактив Таубека)кислоты в уксусном ангидфлавоны и флавонолыридеУксусный ангидрид100 %5-метоксизамещенные флавонолыТолуол – п-сульфокислота 3 % р-р в абсолютном этаЛейкоантоцианидинынолеКарбонат натрия1-5 % водн.
р-рВсе флавоноидыAlCl31-5 % спиртовый р-рФлавоны, флавонолы, халконыАцетат алюминия2-5 % р-рФлавонолыСульфат алюминия1-2 % водн. р-рАнтоцианидиныFeCl31 % спиртовый р-р; 0,5 % р- Все полифенольные соединенияр метанольный р-рЖелезо – аммиачные3 % водн. р-рВсе полифенольные соединенияквасцыFeCl3 + К4Fe(CN)61 % водн. р-рВсе флавоноиды, особенно рекомендуются для изофлавоновТартрат железаВодный р-р при различных Орто-оксифлавоны и флавоны сзначениях рНвицинальными гидроксиламиСредний и основной аце1 % водн. р-рГидроксифилированные эуфлавотат свинцаноидыХлорид тория1 % р-р5- и 3-оксифлавоны5 % р-р в метанолеНасыщенный р-р в СНСl3ZrOCl2 + лимонная ки2 % спирт р-р ZrOCl2, 5 %5- и 3-оксифлавоныслота (реатив Херхаммера водн. р-р лимонной кислотыи Хензель)Ацетат магния5 % р-р в метанолеФлаваноныSbCl3 (реактив МариниНасыщенный р-р в CHCl3ХалконыБеттоло)ТСХ впервые была применена для анализа соединений этого типа в 1957 г.
Стэнли иВаннье. Она является одним из широко используемых приемов в изучении флавоноидных соединений. В таблице 9 приведены адсорбенты и растворители, наиболее часто применяемые вТСХ.Хроматограммы обычно проявляют хроматогенными реактивами (таблица 10), которыеиспользуют для качественных цветных реакций. В таблице 11 приведен цвет флуоресценции26флавоноидов в УФ-свете до и после обработки парами NH3.Таблица 9Адсорбенты и растворители, применяемые для ТСХ различных классов флавоноидов[2,133,215,278]Адсорбент и флавоноидСистема растворителейСиликагельФлавоныБензол – пиридин – НСООН – Н2О (36:9:5), бензол – диоксан – СН3СООН (90:25:4), бензол – ацетон (4:1 и 9:1)О-гликозиды флавоновЭтилацетат – метилэтилкетон – НСООН – Н2О(50:30:10:10), метанол – СН3СООН – Н2О (18:1:1)С-гликозиды флавоновФлавонолыФлаваноныФлавоны и их гликозидыЛейкоантоцианидиныФлавоныО-гликозиды флавоновО-гликозиды флавоноловО-гликозиды флавоноловЭтилацетат – СН3СООН – Н2О (200:20:10), этилацетат –метанол (8:2)Толуол – этилформиат – НСООНБензол – пиридин – НСООН (36:9:5), СНСl3 – CH3ОН –СН3СООН (7:1:1)ЦеллюлозаЭтилацетат – НСООН – Н2О (10:2:3), 20 % СН3СООН, нбутанол – СН3СООН – Н2О (6:1:2), изопропанол – Н2О(22:78)Этилацетат – СНСl3 – НСООН (3:3:1)ПолиамидБензол – этилметилкетон – метанол (90:5:5), 80 %СН3ОН, этанол – Н2О (3:2)Бензол – метанол (1:1), СНСl3 – СН3ОН – бутанол-2(5:3:1), нитрометан – метанол (5:2)СНСl3 – СН3ОН – метилэтилкетон – ацетилацетон(25:10:5:1), этанол – Н2О (3:2), Н2О – этанол – метилэтилкетон – ацетилацетон (10:33:1 и 13:3:3:1)Полиамид + целлюлозаЭтанол – Н2О (95:5)Таблица 10Реактивы, применяемые для обнаружения флавоноидов на хроматограммахРеактивСоединения, которые дают окраску12Аммиак, пары + УФ-светБольшинство флавоноидовКарбонат натрия (5 % р-р) + УФ-светБольшинство флавоноидов (кроме изофлавонов и флаванонов)1 % р-р NаОН в метанолеБольшинство флавоноидов1 % FeCl3»»FeCl3 + К3Fe(CN)6 (1 % р-ры 1:1)»»Основной ацетат свинца + УФ-свет»»SbCl3 (10 % в СНСl3) + УФ-cвет»»Боргидрат натрия (1 % р-р в изопропаноле) +пары HClДиазореактивыZn + HClФлаваноны, изофлаваноныБольшинство флавоноидовДигидрофлавонолы271НСl (газ)Н2SO4 (конц.)AlCl3 (2 % в метаноле) + УФ-светСульфат церия (70 % в H2SO4)2Полностью метилированные флавоныИзофлавоныБольшинство флавоноидовБиофлавоноидыВЭЖХ является одним из наиболее эффективных методов качественного и количественного анализа, разделения, очистки сложных смесей из различных групп природных соединений,водорастворимых витаминов.Таблица 11Флюоресценция флавоноидов при их хроматографировании в тонких слоях до и после обработки парами NH3 [133,215]СоединенияФлюоресценция в УФ-светебез обработкипосле обработки NH3ХалконыЖелтая или коричневаяКраснаяФлаваноныНетНет или слабая желтаяАуроныЖелтая или оранжеваяОранжевая или краснаяФлавоныТусклая коричневаяЯркая желтаяФлавонолыЖелто-зеленаяЯркая желтая, с зеленоватымоттенкомИзофлавоныСлабая розовая или темное пятноНе меняетсяДля ВЭЖХ суммы флавоноидов из растительного сырья используют хроматограф МилиХром А-02.
Исследования флавоноидов проводят до и после их кислотного гидролиза. Для разделения флавоноидных соединений предложено использовать колонки размером 250×4,6 мм,заполненные µ-Бондапаком С18 или Новапаком при использовании в качестве подвижной фазысмесей ацетонитрил-вода-уксусная кислота (50:42:2), (45:55:2), (27:70:0) или (3:0:7) при расходеподвижной фазы 1-2 мл/мин и использовании УФ-детектора (270 нм) [347,383,406,408,423].Спектральные методыДля более детальной идентификации флавоноидов пользуются спектрофотометрией испектрами их поглощения в ультрафиолетовой области (220-400 нм). Спектрофотометрическоеопределение флавоноидов проводят в растворах или непосредственно с хроматограмм послезакрепления окраскипятен специфическимипроявителями [18,31,118,142,190,241,356,357,373].УФ спектр флавоноидов характеризуется наличием, как правило, двух максимумов поглощения.
Положение максимумов и их интенсивность характерны для различных групп флавоноидов (таблица 12).Наиболее часто для идентификации и количественного определения используют дифференциальную спектрофотометрию. Как показал анализ данных литературы, при количествен-28ном определении флавоноидов в растительном сырье и препаратах на его основе большинствомавторов использовался метод, основанный на получении окрашенного комплекса флавоноидовс хлоридом алюминия для исключения вклада в значение оптической плотности других группсоединений с дальнейшим спектрофотометрированием [18,31,118,142,188,239,353,354, 370].Таблица 12Спектральные характеристики флавоноидных соединений [133,215]Группа соединенийОсновной максимум, нмДополнительный максимум, нмКатехины270 – 280–Лейкоантоцианидины270 – 280–Халконы365 - 390240 – 280 (30%)Флаваноны275 – 290; 290 – 330310 – 330 (30%)Ауроны390 – 490240 – 270 (32%)Флавонолы250 – 270; 350 – 390(3-гликозиды 330 – 360 нм)~ 300 (40%)Флавоны250 – 270; 310 – 350–Изофлавоны255 – 265310 – 330 (25%)Для получения окрашенных соединений при применении фотоэлектроколориметрическихметодов используются реактивы, дающие яркие, устойчивые окраски.
Часто используется реакция образования цианинхлорида из дигидрокверцетина при его обработке цинковой пылью вприсутствии соляной кислоты [18,31,118,142,190,241,356,357,373].Гравиметрические методыГравиметрические методы определения флавоноидов являются наиболее примитивными иоснованы на кристаллизации или осаждении их из воды и неполярных органических растворителей. Методы просты в исполнении, но длительны, т.к. выделившийся осадок отделяют фильтрованием или центрифугированием, высушивают и доводят до постоянной массы. Кроме того,метод дает завышенные результаты, потому что вместе с БАВ осаждаются и сопутствующиевещества.
Но для некоторых видов сырья, например, содержащего полисахариды, этот методнаиболее специфичен, чем для флавоноидов [133,215].Титриметрические методыТитриметрические методы основаны на химических свойствах флавоноидов. Наличие фенольных гидроксильных групп обусловливает кислые свойства флавоноидов и их способность кобразованию фенолятов в щелочной среде. Кислотность различных гидроксильных групп уфлавоноидов различна. Неводное титрование флавоноидов проводят в среде диметилформамида, точку эквивалентности устанавливают по индикатору или потенциометрически.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
