Диссертация (1139719), страница 9
Текст из файла (страница 9)
АК,содержащие серу, определяют, используя йодометрический метод (цистеин и ацетилцистеин).38Метионин, как указано в ФС, растворяют предварительно в растворе, состоящем из смеси дикалийфосфата и монокалийфосфата в присутствии KI, а далее окисляют раствором йода (0,1 М)[90]. При титровании комплексонами ряда АК используется образование хелатов типа Сu(АК)2.Титруют при pH 9 раствором сульфата меди (II) с обавлением в качестве индикатора - мурексида[379].Элeктро-химичeскиe мeтодыМетоды капиллярного электрофореза (КЭ), основанные на разделении сложных компонентных смесей в капилляре из кварца под воздействием приложенного электрического поля,широко используются для определения α-АК в ЛП, биологических жидкостях, комбикормах ипродуктах питания [75,83,379,395].Для количественного определения АК в растворах применяют потенциометрическоетитрование. АК при титровании щелочами присоединяют протон и ведут себя как двухосновные.Титрантом служит раствор КОН (0,01 моль/л) в безводном этаноле.
Индикаторным электродом является стеклянный электрод; электрод сравнения - хлорид-серебряный электрод приневодном титровании [317]. На высокоомном потенциометре измеряют электродвижущую силураствора. Вид дифференциальной кривой потенциометрического титрования имеет пик, соответствующий количественному содержанию АК в анализируемой пробе.Предложена постадийная процедура улучшения кондуктометрического биосенсора длявыполнения определения содержания L-аргинина в биологической жидкости - сыворотке крови.Такой биосенсор для количественной оценки L-аргинина содержит уреазу и аргиназу, совместно иммобилизованные на инертном носителе методом поперечной сшивки [317,424].Оптические методыБольшинство АК, за исключением глицина, благодаря хиральному строению обладаютоптической активностью. Частные ФС отечественных и зарубежных фармакопей нормируют вводных и солянокислых растворах величину удельного вращения различных АК [90,92,400403,431,432].Протеиногенные АК в раствора в видимой части спектра практически не поглощают.Для ароматических АК (триптофана, фенилаланина, тирозина) в УФ-oбласти наблюдается вдиапазоне 240-300 нм высокое поглощение.
На этом основаны простые экспресc-методы ихколичественного определения. Однакo, ошибки анализа возможны при количественном определении отдельных ароматических АК, в виду того, что максимумы поглощения этих АКблизко расположены. Поэтому, данный метод анализа используется в качестве предварительного и, в большинстве случаев, необходимо дополнительное исследование с помощью ГЖХ,ВЭЖХ и анализаторов АК [317, 379].39Также для анализа широко используют методы, основанные на реакции АК с нингидрином [195,227,251,317,379,405].Ярыгиной Т.И. с соавторами изучены спектры адсорбции продуктов реакции нингидрина с АК, полученных при pH раствора 6,4. Разработаны методы количественного анализа аминалона в таблетках и субстанции, аминокапроновой кислоты в растворах для инъекций, фенибута в таблетках.
Метод характеризуются простотой исполнения и высокой точностью, не требует дорогостоящего оборудования, а поэтому может быть воспризведе в любой лаборатории[195,227,251,317].Предложена для количественного определения цистеина в биожидкостях методика, основанная на red-ox реакции с солями железа (III) в присутствии 1,10-фенантролина с последующей спектрофотометрической оценкой содержания продукта реакции. Методика характеризуется высокой точностью и простотой определения [317,379].Разработан метод спектрофотометрической количественной оценки продукта реакцииАК с альдегидом о-фталевым с целью устновления содержания суммы АК в сыворотке крови.Продукт реакции определяют спектрофотометрическим способом при длине волны 340 нм вприсутствии меркаптоэтанола.
Метод довольно высокочувствительный и позволяет определитьколичественно все α-АК, кроме пролина, цистина и оксипролина [317,379].В соответствии с ГОСТом [75,83] колориметрический способ определения содержаниятриптофана с п-диметиламинобензальдегидом основывается на расщеплении в белках пептидных связей в щелочном растворе бария гидрокисида при нагревании и последующем окрашивании свободного индольного цикла триптофана п-диметиламинобензальдегидом. В присутствиинитрита натрия в сильно кислой среде образуется голубая окраска, интенсивность которой измеряется на фотоэлектроколориметре.Описан способ, позволяющий проводить селективное определение пролина или триптофана в присутствии других АК.
Для чего к раствору пробы прибавляют избыток реактива 7хлор-4,6-динитробензофуроксана, раствор нейтрализуют и регистрируют величину абсорбции вобласти 500 - 550 нм. 7-хлор-4,6-динитробензофуроксан в данных условиях в анализируемойсмеси реагирует со всеми АК. Однако контрастность продуктов взаимодействия (сдвиг положения максимума светопоглощения продукта реакции по сравнению с пиком поглощения реагента) для триптофана и пролина значительно больше, чем для других АК, что дает возможностьселективно определять данные АК в сложных смесях АК без предварительного их разделения[317,429].ИК-спектры АК характеризуются отсутствием полосы поглощения нормальных валентных колебаний в интервале 3300 - 3500 см-1, наблюдается светопоглощение при 3070 см-1, относящееся к H3N+-группе. Данная полоса присутствует также в спектрах гидрохлоридов АК.
Вме-40сте с тем, две специфические полосы H3N+-группы находятся в диапазоне 1500 - 1600 см-1. АК иих соли имеют поглощение при 1560 - 1600 см-1, характерное для СОО-. Карбонильное светопоглощение СООН-группы при 1700 - 1730 см-1 у солей АК и хлористоводородной кислоты сдвинуто на 20 см-1 в коротковолновую область. Частокол полос находится в области 2500 - 3030 см1. Основные характеристические полосы поглощения, определяющие структуру АК, приведеныв таблице 19.Таблица 19Характеристические частоты поглощения в ИК-спектрах АК и их отнесение к структуре[127,150,162,317,343]Примеры АКЧастота колеИнтенсивностьФункциональные группы и типбаний на спекколебанийколебанийтре, см-1АК, содержащие3130-3030ν N-H, среднееH3N+-группа, валентные колеNH2-группыбания1660-1610δ N-H, слабоеАминокислотная полоса I,H3N+-группа, деформационныеколебания1550-1485δ N-H, среднееАминокислотная полоса II,H3N+-группа, деформационныеколебанияα-АК, содержа1755-1720сильноеКолебания C=O в СООН групщие две карпе, валентныебоксильныегруппыАК, содержащие1730-1700сильноедве карбоксиль1230-1215сильноеКолебания связи С-О-Сные группыВсе АК1600-1560сильноеКолебания -COO-группы2760-2530слабое2140-2080слабое1335-1300среднееСоли АК H2N-(CH2)n-COO-Me+H2N3400-3200ν N-H, сильноеДве полосы поглощения-COO1600-1560сильное+Гидрохлориды АК [H3N -(CH2)n-COOH]Cl+H3N 3130-3030среднееν N-H в H3N+-группе, валентныеслабоеколебания+1660-1610переменноеH3N -группа, деформационныеколебания1550-1485среднее1335-1300сильноеКолебания связи -С-О1230-1215Масс-спектроскопия заняла особое важное место при анализе последовательности АК вбелках.
Возможно легко определять различные АК благодаря высокой интенсивности отдельных молекулярных пиков в виду малого фрагментирования и относительно слабого взаимодействиямеждумолекулами.Приэтомполучаютспектрысвысокимразрешением41[317,384,386,399, 409,419]. Разложение на стабильные мезомерными превращениями иминиевые ионы и относительно устойчивый радикал -СООН и фрагмент боковой цепи характерно дляα-АК. Дальнейшее фрагментирование индивдуально и зависит от строения боковой цепи. Авторы в работе [317] методом ВЭЖХ-МС провели идентификацию и разделение основных протеиногенных АК в виде N-[(6-хинолиниламино)карбонил]-производных.Хроматографические методыВесомые успехи были достигнуты за последнее время в области анализа АК с помщьюГЖХ. Метод ГЖХ с применением микронабивных колонок, дающий возможность разделясь свысокой степенью разрешения 17 незаменимых α-АК за сравнительно короткое время, былпредложен авторами [317, 379,381,391,399, 418,420-422].В результате использования разработанной ГЖХ-методики определения АК, базирующейся на получении производных 2,3,4,5,6-пентафторбензоил-изобутиловых эфиров и дальнейшемразделениинаколонке,заполненнойполидиметилсилоксаномспламенно-ионизационным детектором, при температуре от 140 до 250 °С, удалось разделить 27 АК[317,379] в образцах различных биологических жидкостей (плазма крови, сыворотка, моча испинномозговая жидкость).Основной значительный недостаток ГХ, в целом, заключается в том, что для анализатруднолетучие АК нужно сначала перевести в легколетучие производные.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
