Диссертация (Возможности использования тканеинженерных конструкций в хирургическом лечении тазового пролапса), страница 6

Имплантацию полученных конструкций производили подкожнов межлопаточную область у мышей. В результате образовывался тканеинженерный аналог фасции 40. Kapischke M., Prinz K., Tepel J. (2005) и MangeraA., Bullock A.J., Macneil S. (2010) предприняли попытку использованияфибробластовсцельюулучшениябиосовместимостиимплантированныххирургических сеток. Человеческие фибробласты, полученные после заборакультуры клеток из влагалища, крайней плоти и щеки, культивировали в условияхin vitro на различные полипропиленовые сетки и сетки из биологическогокомпонента с целью обеспечения биосовместимого покрытия на границе междуимплантатомитканью.Эффективностькультивированияклетокнаполипропиленовые сетки была ниже, чем на биологических сетках, однакодальнейшего исследования в условиях in vivo не проводились 47; 61.

Drewa исоавт. (2005), с другой стороны, использовали 3 T3 мышиные фибробласты,культивированные в условиях in vitroна синтетическую биодеградируемыеэндопротезы, состоящие из полигликолевой кислоты с целью для более27успешного закрытия дефекта передней брюшной стенки у мышей 26.Фибропластическая гладкомышечная ткань стенки влагалища и ее опорная тканьсодержат много фибробластов, что объясняет идею использования аутологичныхклеток влагалища в качестве улучшения методов лечения тазового пролапса.

Нобольшинство попыток оказались неудачными в следствие молекулярных иклеточных особенностей данной патологии.Мезенхимальные стромальные клетки обладают плюропотентностью испособны дифференцироваться в различные типы ткани (в костную, хрящевую,жировую, ткани связок и сухожилий, и гладкомышечную ткань).

Процессдифференцировки определяется микроокружением в области имплантации. Такимобразом, аутологичные мезенхимальные клетки, полученные, например, изжировой ткани, могут идеально подходить для хирургического лечения тазовогопролапса. Мезенхимальные стромальные клетки из костного мозга или жировойткани доступны в получении и культивировании. Их широко применяют вразличных медицинских отраслях с целью восстановления и регенерацииповрежденных тканей.

Например, в урогинекологии для восстановленияуретрального сфинктера при лечении стрессового недержания мочи можноиспользовать стволовые клетки, полученные из костного мозга и жировой ткани78. Zou и соавт. (2010) удалось успешно провести лечение синдромаимперативного мочеиспускания у крыс, полученного в следствии пересеченияседалищного нерва. Лабораторным животным имплантировали субуретральноподложку из биодеградируемого шелкового волокна, покрытую аутологичнымиклетками костного мозга 80.Kunisaki S.M. c соавт.

(2006) считают, что мезенхимальные амниоциты,культивированные на композитную биологическую сетку, содержащую в своемсоставе обесклеточную человеческую дерму, подслизистую оболочку тонкойкишки и коллагена, показали лучшие результаты по сравнению с фетальнымимиобластами в реконструкции диафрагмальных грыж у новорожденных ягнят50. Dolce и соавт. (2010) провели исследования, в результате которых было28доказано, что стволовые клетки костного мозга хорошо культивируются наполигликолевых сетках, улучшая их биосовместимость, снижая образованиеинтраабдоминальных спаек после имплантации у лабораторных животных напримере крыс 25.Группой австралийских хирургов (Ulrich D., Edwards S.L., Su K., 2013)описаны результаты хирургического лечения тазового пролапса с использованиемполиамидных сетчатых имплантатов, покрытых мезенхимальными стволовымиклетками человеческого эндометрия.

В месте имплантации сетки с МСКэндометрия при гистологическом исследовании на 7 сутки отмечаласьзначительная неоваскуляризация (р <0,05), а к 90 суткам происходило снижениеколичества макрофагов и инфильтрации лейкоцитов (р <0,05) 73.Китайским исследователям во главе с Hung M.-J. (2013) удалосьпродемонстрироватьулучшениерегенеративнойспособноститканейприхирургическом лечении пролапса гениталий при применении тканеинженерныхконструкций на сетчатых имплантатах с коллагеновым гелем, покрытыхмезенхимальными стволовыми клетами жировой ткани по сравнению с тем жесетчатым имплантатом без клеточного покрытия. Активность экспрессииколлагена I типа и эластических волокон фиксировалась на 4 неделе послеимплантации крысам, а также отмечались изменения в клеточной морфологии(изменилась конфигурация клеточного ядра) [41].Shi L.B.

(2014) с соавторами описали в своем исследовании применениемикросфер из фиброина шелка, покрытых мезенхимальными стволовымиклетками, полученных из жировой ткани с целью имплантации в 4 точки вокругмочеиспускательного канала крысам с инконтиненцией [70]. Производилиодномоментное рассечение пудендального нерва, которое приводило к снижениюнервно-импульсного воздействия на мочевой пузырь.

Восстановление нервногоимпульса и площади поврежденного участка фиксировалось через 4 недели послеимплантацииконструкций.Окончательноезаживлениеивосстановлениефункции мочевого пузыря происходило спустя 8 и 12 недель после имплантации.29В 2013г были проведены исследования группа Австралийских хирургов(UlrichD.,SharonL.,2006)[72 .Вэкспериментахиспользовалисьтканеинженерные конструкции на основе полиамидных сетчатых имплантатов,покрытых слоем мезенхимальных стволовых клеток из человеческий эндометрий.Отмечалось уменьшение процента отторжения данных конструкций и увеличениеих прочности за счет прорастанием фибриновыми волокнами по сравнению сконтрольными полиамидными сетками.В создании матриц графтов в последние десятилетия отмечена тенденция киспользованию биоразлагаемым природным полимерам (альгинатам, коллагену,желатину,хитозанам,происхождения–фиброинам шелка)иполиэфирамполигидроксиалканоатамбактериального(ПГА),синтезируемыхмикроорганизмами.

К примеру, шелк паутинной нити является уникальнымматериалом, в котором одновременно сочетается высокаяпрочность иэластичность. При этом данный материал обладает хорошей биосовместимостью,что делает использование шелка перспективным в тканевой инженерии. Впрочем, не стоит забывать о технических трудностях при получении природногопаутинного шелка, что даёт основание полагать о нерентабельности широкогоиспользования данного материала в практическом применении. Однако, в ГосНИИ генетика отечественным ученым под руководством Пустоваловой О.Л.(2009) удалось расшифровать гены паутинных белков. Полученные данныесделали возможным получение белка 1F9 - аналога спидроина 1 паука Nephilaclavipes, который может стать основой при создании матриксов для тканевойинженерии [103].Зарубежным аналогом биодеградируемого имплантата можно считатьBombyx mori, который является регенерированным фиброином шелка [110,111].Группа исследователей (Li Q, Wang J, Liu H, Xie B, Wei L, 2013; Агапов И.

И.,МойсеновичМ.М.,2013)провеласравнениескоростиобразованияжизнеспособного монослоя из культуры мезенхимальных стволовых клеток,полученныхизжировойтканинаматриксахизполипропиленаирегенерированного фиброина шелка Bombix mori. Перспективной была признана30тканеинженерная конструкция на основе биодеградируемого матрикса за счетповышения биосовместимости основы эндопротеза и экспрессии коллагена I и IIIтипа, влияющей на прочность вживляемости в межфасциальные слои пациента.Kim H.J. et al (2007) в своем исследовании для улучшения регенерациикостной ткани использовали в качестве графта жидкий фиброин шелка, покрытыйчеловеческими мезенхимальными стромальными клетками костного мозга.Клеточный компонент на 56 сутки культивирования образовывал плотныйдвухярусный слой новой ткани. Полученная тканеинженерная конструкцияспособствовала росту колоний остеобластов за счет усиления пролиферации собразованием внеклеточного матрикса 48.В настоящее время исследуются свойства этих материалов, а такжевозможность их практического использования.

К недостаткам природныхбиополимеров относят высокую стоимость их получения, сложность обработки,недостаточную механическую прочность 99.Создание современных тканеинженерных конструкций может явитьсяодним из путей повышения качества хирургического лечения пролапса гениталий.ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.2.1. Общая характеристика экспериментального материалаДля решения поставленных задач работа проводилась по трем основнымнаправлениям–1)полученииаутологичногоклеточногоматериаламезенхимальных стромальных клеток костного мозга, выделенных у крыс Вистар,создание ТИК на основе бионедеградируемой полипропиленовой хирургическойсетки, оценка жизнеспособности ТИК и биосовместимости в условиях in vivo(имплантация контрольной и опытной сеток в подапоневротическое пространствона передней брюшной стенки у крыс Вистар, патоморфологический контроль насроках2 и 4,5 месяца); 2) получении аутологичных дермальных фибробластовкрыс Вистар, выделенных из фрагментов кожи, создание ТИК на основе31бионедеградируемых (полипропиленовой и титановой сетках), биодеградируемых(викриловая сетка и биологический имплантат из свиного коллагена) матриксах икомпозитнойсеткеизполилактогликолидасполипропиленом,оценкажизнеспособности ТИК и оценка биосовместимости в условиях in vivo(имплантация производилась в межлопаточную область в сформированныекарманы у крыс Вистар), патоморфологическое и иммуногистохимическоеподтверждение на сроках 7, 14 и 21 сутки после имплантации; 3) получениеклеточного материала дермальных фибробластов кожи человека, создание ТИКна основе бионедеградируемых полипропиленовых сеток с разным диаметроммонофиламентных волокон, оценка степени покрытия клетками хирургическихсеток и жизнеспособности ТИК в условиях in vitro.

Производилась отработкапротокола получения клеточного препарата мезенхимальных стромальных клетокиз костного мозга, дермальных фибробластов из фрагментов кожи, изучениединамики тканевой реакции в организме животных в ответ на имплантациюклеточно-инженерных конструкций; проведение сравнительного исследования пооценке взаимодействия аутогенного клеточного компонента (мезенхимальныхстромальных клеток (МСК) костного мозга крысы и дермальных фибробластовкожикрысы,дермальныхфибробластовчеловека)сотобраннымибиодеградируемыми и бионедеградируемыми сетчатыми имплантатамисоптимальными свойствами для адгезии, пролиферации на нем клеток, а такжеоценки возможности формирования сплошного, изолирующего материала,клеточного покрытия и оценка сроков образования клеточно-инженернойконструкции из разных типов клеточного компонента.Исследование проведено на 55 белых крысах-самцах породы Вистар весом250-270 г, содержащихся в Центральном виварии Первого МГМУ им.