Диссертация (1139934), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Далее производилось непрерывное соединение нитью Полисорб 2-0собственной фасции мышцы и зашивание кожи с подкожной клетчаткой(рисунок 31).Рисунок 31 - Ушивание нитью Полисорб 2-0 непрерывным швом кожи.2.3. Технология получения культур мезенхимальных стромальных клетоккостного мозга (МСК КМ) и дермальных фибробластов (ДФ).Работа по выделению клеток и их культивированию проводилась всоответствии с общими принципами осуществления исследований с культурамиклеток.552.3.1. Получение и культивирование мезенхимальных стромальных клетоккостного мозга (МСК КМ).Костныймозгявляетсяуникальныморганом,осуществляющимфункционирование двух различных типов стволовых клеток (гемопоэтических ипостнатальных стволовых клетки).
Формирование гемопоэзиндуцирующегомикроокружения(ГИМ)истромальногомикроокружения,участиевсамоподдержании и восстановление пула МСК - основополагающие функциимезенхимальных стромальных клеток костного мозга. Костный мозг активноучаствует в гомеостатических реакциях организма и в процессах регенерации,репарации и адаптации системы мезенхимальных клеток в норме и патологии.Общими свойствами для всех мезенхимальные стромальных клетокявляются: способность к симметричному и асимметричному делению, наличиевысокого пролиферационного потенциала и высокой способности к адгезии, приэтом у всех клеток схожая фибробластоподобная морфология, они легкоподдаются дифференцировке.Клеточнуюкультурукостногомозгаполучаютпутемпункцииаспирационной иглой эпифиза бедренных костей у лабораторных животных(крыс). Однако, в костном мозге присутствует лишь небольшое количествовнеклеточного матрикса, стромы и гематопоэтических клеток.
Необходимопроводить несколько пассажей аспирационной иглой малого диаметра. Принизкойплотностикостномозговыепосевастволовыетакойклеточнойсуспензии,клеткибыстроадгезируются,стромальныеприобретаяфибробластоподобную морфологию, хотя возможно и сохранение округлойформы при культивировании, после чего могут быть отделены от не адгезивныхгематопоэтических клеток посредством повторных отмываний (рисунки 32, 33).
Вусловиях культуры с использованием необходимых питательных сред, сывороткиМСК (стромальные) образуют клеточные колонии, каждая из которых происходитот одной клетки предшественника. Попадая в ткани реципиента, МСК костного56мозга способны встраиваться за счет слияния с резидентными клетками.Мезенхимальные стромальные клетки костного мозга, полученные улабораторных животных ферментативно диссоциировались с добавлениемколлагеназы II типа (Gibco), доводя до конечной концентрации 0,075% в течение60 мин в температурном режиме - 370 С. Затем производилась инактивацияколлагеназой при помощи добавления равного объема полной питательной средыDMEM/F12 (Gibco), которая содержала 10 % фетальной бычьей сыворотки(HyClone), 2 ммоль/л L-глутамина и 100 Ед/мл Стрептомицина (Invitrogen).Полученная суспензия центрифугировалась в культуральной среде объемом 15мл, далее производили посев на культуральный флакон (25 см2, Corning)первичной клеточной культуры, которую инкубировали при температуре 370С ватмосфере, содержащей 5% СО2 с повышенной влажностью.
Проводился пассажклеток с добавлением 0,25% раствора трипсина/EDTA (Gibco).Заменапитательной среды производилась дважды в неделю. Второй пассаж клеточнойкультуры забирался для дальнейшего экспериментального исследования (рисунок33).Оценка жизнеспособности проводилась при помощи окраски клетоктрипановым синим в счетчике TC-10 (Bio-Rad).Рисунок 32 - Первичная культура МСК КМ на 5-е сутки культивированиязабранная у интактных крыс. Увеличение ×200, фазовый контраст.57АБРисунок 33 - Культура МСК КМ интактных крыс: А – первый пассаж (10-е суткикультивирования).
Б – второй пассаж (14-е сутки культивирования). Увеличение ×200, фазовый контраст.2.3.2. Получение и культивирование дермальных фибробластов (ДФ).Для получения дермальных фибробластов были выбраны двадцатьлабораторных крыс Вистар: у которых производился забор эпидермиса кожиразмером 5х5 мм.Забранные образцы тканей помещали в транспортную среду с 3-х кратнымразведением антибиотиков (3% раствор пенициллина/стрептомицина, Invitrogen),далее производили тщательное промывание в изотоническом забуференномфосфатомрастворе(PBS)вусловияхлаборатории.Ферментативноедиссоциирование ДФ кожи человека проводили при помощи добавленияколлагеназы II типа (Gibco) до конечной концентрации 0,075% в течение 60 минпри температуре 370С.
Затем осуществлялась инактивация коллагеназой в равномобъеме полной питательной среды DMEM/F12 (Gibco), содержащей 10%фетальнойбычьейсывороткипенициллина/стрептомицина(FBS,(Invitrogen).HyClone)иПолученная1%растворсуспензияцентрифугировалась в культуральной среде объемом 15 мл, а далее производилипосев первичной клеточной культуры на культуральный флакон (25 см2, Corning)и инкубирование при температуре 370С в атмосфере, содержащей 5% СО2 сповышенной влажностью. Замена питательной среды производилась каждые 4858часа.
Пассаж клеток осуществлялся при помощи 0,25% р-ра трипсина/EDTA(Gibco). Клетки третьего пассажа были готовы к нанесения на матриксы.Фибробласты имеют мезенхимальное происхождение (мезенхима являетсяэмбриональнойсоединительнойтканью).Средимезенхимальныхклетоквстречаются стволовые клетки.Фибробласты являются клетками соединительной ткани, количествокоторыхвразличныхтипахтканейвариабельно.Формаклеток-веретенообразная с отходящими тонкими длинными отростками (рисунок 34). Построению фибробласты представляют собой клетку с овальным ядром, зернистойэндоплазматической сетью и с хорошо развитым комплексом Гольджи. Клеткиимеют конечное время роста и с течением времени превращаются в фиброциты,которые так же представлены веретенообразной формой и имеют крупноеэллипсоидное ядро с мелким ядрышком.
В отличие от фибробластов, уфиброцитов остальные органеллы развиты слабо.Рисунок 34 - Дермальные фибробласты в виде веретенообразных клеток.Стрелкой указано на адгезивную клетку. Дермальные фибробласты кожичеловека и лабораторной крысы имеют схожее строение.Главной функцией фибробластов является образование основного веществаи волокон за счет активного синтеза компонента межклеточного вещества.Фибробластамисинтезируютсятропоколлагены,которыеявляютсяпредшественниками коллагена нескольких типов, и межклеточный матрикс,представленныйламинином,нидогеном,тинасцином,протеогликаноми59фибронектином.
В процесссах адгезии и стимуляции пролиферации наиболееважнымявляетсяобразованиефибронектина(высокомолекулярногогликопротеина, синтезируемого фибробластами).2.4. Технологические этапы создания тканеинженерных конструкций фасцииСозданиетканеинженернойконструкциинаосновехирургическихимплантатов (эндопротезов) и клеточного компонента состоит из несколькихпоследовательных этапов, представленных на технологической схеме (рисунок35). Данные работы по созданию ТИК проводили в Центре коллективногопользования«Регенеративнаямедицина»СеченовскогоУниверситетанаУникальной научной установке «Технологический комплекс чистых помещенийдля производства клеточных продуктов» - GMP лаборатории с чистымипомещениями 5-6 классов по международной классификации ISO, оснащеннойоборудованием для исследований в области клеточных технологий.Рисунок 35 - Технология создания тканеинженерной конструкции фасции.602.4.1.
Подготовка хирургических имплантатов для заселения культурамиклетокВ стерильных условиях ламинарного бокса были извлечены из упаковкихирургические имплантаты. Имплантаты были замерены, размечены и нарезанына фрагменты заданных размеров (10×10 мм). Заранее была подготовленакультуральная посуда (шестилуночные планшеты, Nunc) для размещениянарезанных фрагментов, а также полная питательная среда для культивированиясоответствующего типа клеток.
После размещения в планшеты фрагментызаливали питательной средой. В случае, если фрагменты оказываются легчепитательной среды и в ней всплывают, то их необходимо закрепить на дне лунки.2.4.2. Подготовка клеточного компонента ТИККлетки культивировали в соответствии с описанием в разделах 2.3.1 и 2.3.2.Клетки снимали ферментативным способом (Tryple, Invitrogen), отмывали,оценивали жизнеспособность в соответствии с описанием в разделе 3.1,подсчитывали количество, центрифугировали и подготавливали суспензию сконцентрацией 4×104 клеток на 100 мкл питательной среды.2.4.3. Иммобилизация культур клеток на подготовленном материалеимплантатаНа подготовленные фрагменты после размещения в лунках культуральногопластикового планшета капельно при помощи автоматической пипетки снаконечником 200 мкл (Ленпипет, Thermo Fisher) наносили концентрированнуюсуспензию клеток.
Планшет устанавливали в СО2 инкубатор на 1 час, после чеголунки медленно наполняли полной питательной средой и снова устанавливали вСО2 инкубатор со стандартным режимом – повышенная влажность, 370 С, 5%СО2.612.4.4. Динамическая оценка пролиферации клеток в составе ТИКЕжедневно контролировали адгезию и пролиферацию клеток на фрагментахимплантатов с помощью световой микроскопии с фазовым контрастом (Nikon).При изменении положения клеток на поверхности имплантатов делалимикрофотографии при различных увеличениях для динамической оценкипролиферации.Динамикавключалаадгезиюотдельныхклеток,ихраспластывание вдоль волокон материала, распределение на поверхность узловнитей волокон, покрытие всей поверхности материала и постепенное закрытиеячеек (промежутков) сетки при их относительно небольших размерах.2.4.5. Оценка жизнеспособности клеток в составе ТИКОтдельные образцы фрагментов подготавливали одновременно с опытнымиобразцами в одинаковых условиях для проведения анализа по оценкежизнеспособности клеток в составе ТИК.
Для данного исследования применялиокраску Live/Dead и конфокальную микроскопию в соответствии с описанием вразделе 3.1. Для подтверждения качества созданной конструкции2.5. Методы исследования полученных тканеинженерных конструкций2.5.1. Морфологический метод исследованияМорфологический метод в нашей работе представлен гистологическимисследованием. Полученные кусочки ткани с имплантатом (тканеинженернойконструкцией на бионедеградируемых, композитных и биодеградируемыхматрицах с аутологичным клеточным компонентом или контрольные сетчатыеимплантаты) фиксировали в 10% нейтральном формалине. Гистологическоеисследование проводили на парафиновых срезах толщиной 5 мкм окрашивалисьгематоксилин - эозином, пикрофуксином по Ван - Гизону, изучались в62микроскопе Olympus BX51, фотографировались с помощью видеокамеры фирмыСпецтехника (Москва) и программы Launch CAM VIEW.
Оценка срезовпроизводилась на сроках 7, 14, 21 день, а также через 2 и 4,5 месяца.2.5.2. Микроскопический метод исследования (световая и конфокальнаямикроскопия)Принцип работы светового микроскопа заключается в том, что пучок светаот источника освещения собирается в конденсаторе и направляется на объект.Пройдя через него, лучи света попадают в систему линз объектива. Онивыстраивают первичное изображение, которое увеличивается при помощи линзокуляра. В целом объектив и окуляр дают обратное мнимое и увеличенноеизображение объекта.Световую микроскопию осуществляли на микроскопе Nikon TE-2000 приувеличениях ×40, ×60, ×100, ×200, ×400 с фазовым контрастом. С помощьюданного метода оценивалась морфологическая структура клеток, а также оценкаадгезию применяемых клеток на нитях через 24 часа.Конфокальнаямикроскопия–этоодинизметодовоптическоймикроскопии, который обладает существенным контрастом по сравнению собычными классическими микроскопами.
Отличительной особенностью данногометода является использование диафрагмы, способной отсекать поток фоновогорассеянного света.Образцы окрашивали набором Live/Dead (акридиновым оранжевым иэтидиумом бромидом) для определения жизнеспособности клеток в составе ТИК.В результате происходило окрашивание акридиновым оранжевым живых клеток,а этидиумом бромидом – мертвых клеток.Локализацию флуоресценции образцов фиксировали с помощью лазерногосканирующего конфокального микроскопа LSM-710 (Carl Zeiss Microscopy, Jena,Germany).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
