Диссертация (Иммуногенетические маркеры прогнозирования эффективности программ экстракорпорального оплодотворения у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием), страница 8

Такжеоценивалась репродуктивная функция (количество беременностей, способ ихдостижения, течение, исход, наличие осложнений). Особое вниманиеобращалинаналичиеванамнезегинекологическихзаболеваний,оперативных вмешательств на органах малого таза, объем операции, течениепослеоперационного периода и данные гистологического исследования.Устанавливали причины и длительность бесплодия.Припроведенииобщегоосмотраженщиноценивалисьтиптелосложения, рост, масса тела.

Исследовалась степень нарушения жировогообмена по формуле: ИМТ = М/Р2 , где ИМТ – индекс массы тела; М – массатела, кг; Р – рост, м.При проведении гинекологического исследования оценивались типполового оволосения, правильность развития наружных половых органов,состояние слизистой влагалища и шейки матки. При бимануальномисследовании определяли положение, размер, форму и консистенцию матки,ее подвижность, болезненность при пальпации, а также наличие образованийв области придатков матки, степень выраженности спаечного процесса.Осмотршейкиматкипроводилсясиспользованиемрасширеннойкольпоскопии.

Взяты мазки-отпечатки на онкоцитологию.Этапы проведения программы ЭКО и ПЭСо 23-го дня менструального цикла проводилась стимуляциясуперовуляции препаратами рекомбинантного фолликулостимулирующегогормона (Гонал-Ф). Начальная их дозировка подбиралась индивидуально в44зависимости от возраста женщины и показателей овариального резерва.Когда лидирующий фолликул достигал диаметра 1314 мм, подкожновводился препарат-антагонист гонадотропин-рилизинг гормона (Цетротид(0,25 мг/сут)) ежедневно, включая день введения триггера овуляции. Дляфинальногосозреванияооцитоввнутримышечновводилсяпрепаратхорионического гонадотропина 5 000 МЕ за 35 часов до пункции яичников.Трансвагинальная пункция проводилась в асептических условиях малойоперационной под внутривенной анестезией и ультразвуковым контролем.Аспирировали фолликулярную жидкость под давлением (90100 мм водн.ст.) в стерильные пробирки с 0,5 мл гепарина (2 500 ЕД/мл).

Полученнаяфолликулярнаяжидкостьнемедленнопередаваласьэмбриологудляидентификации ооцитов, оплодотворения и культивирования эмбрионов.Оплодотворение in vitro: преинкубацию, оплодотворение ооцитов сиспользованием стандартов ЭКО, культивирование эмбрионов проводили вспециальныхсредахфирмы«Origio»(Дания).Качествоэмбрионовоценивалось после ЭКО на основании совокупности морфологическиххарактеристик в соответствии с установленными критериями.Перенос эмбрионов проводился врачом акушером-гинекологом на 5-есутки культивирования с помощью мягкого катетера «Wallace». Числопереносимых эмбрионов определялось индивидуально (не более двух),оставшиесяэмбрионыотличногоихорошегокачествакриоконсервировались.В посттрансферный период применяли препараты дидрогестерона содня проведения трансвагинальной пункции яичников 20 мг/сут, а послепереноса эмбрионов в полость матки  40 мг/сут по общепринятой методике.Диагностика беременности проводилась на основании определения всывороткекровиконцентрацииβ-субъединицыхорионическогогонадотропина через 14 дней после переноса эмбрионов в полость матки.Тест считали положительным при ее уровне более 30 МЕ/л (биохимическая45беременность).

Через 21 день после переноса эмбрионов проводиласьультразвуковая диагностика клинической беременности с целью определенияколичества плодных яиц в полости матки. На 31-й день осуществляли УЗсканирование для выявления сердцебиения плода.2.2.2. Исследование гормонального статусаИсследование гормонального статуса проводили радиоиммунным ииммуноферментным методами с применением стандартных наборов.Таблица 2.1Нормативные показатели гормонов в сыворотке крови у женщинрепродуктивного возрастаПоказательНормативыЛГ1,1–8,7 мМЕ/млФСГ1,811,3 мМЕ/млЭстрадиол30120 пг/млПролактин67726 мЕд/млТестостерон0,54,3 нмоль/лДГЭА-С35430 мкг/дл17-ОН0,28,7 нмоль/лКортизол200700 нмоль/лТТГ0,233,4 мкМЕ/млТ31,02,8 нмоль/лТ41025 пмоль/лАМГ2,17,3 нг/млПрогестерон7,056,6 нмоль/л46В раннюю фолликулярную фазу  на 2-3-й день менструального циклаопределяли концентрацию в крови ЛГ, ФСГ, эстрадиола, пролактина,тестостерона, ДГЭА-С, 17-ОН, кортизола и АМГ.

Во вторую фазуменструального цикла (2022-й день) определяли концентрацию в кровипрогестерона (табл. 2.1)2.2.3. Ультразвуковое исследование органов малого тазаУльтразвуковое(Германия)сисследованиеиспользованиемПервоначальнопроводилинатрансвагинальногопроводилосьаппаратедатчикатрансабдоминальноеSiemens7,5МГц.ультразвуковоеисследование (с наполненным мочевым пузырем), в ходе которогоисключались объемные образования органов малого таза. Далее проводилосьтрансвагинальное ультразвуковое исследование (при опорожненном мочевомпузыре).Обращаливниманиенабиометрическиепоказателиматки(положение, размеры), состояние миометрия (структура, наличие узлов, ихразмеры и структура), эндометрия (структура, толщина, диагностикапатологическихсостоянийсинехии,хронический эндометрит, гиперплазия),внутриматочныеперегородки,яичников (размеры, структура,количество и размеры антральных фолликулов) и наличие объемныхобразований в малом тазу.Исследование проводилось перед началом стимуляции суперовуляции(23-й день менструального цикла), в ходе ультразвукового мониторинга вцикле ЭКО и для диагностики предполагаемой беременности.2.2.4.

Иммуноферментные исследованияМетодом ИФА в сыворотке крови определяли содержание M-CSF сиспользованием коммерческих тест-систем «RnDSystems» (США) и уровень47IL-1α, IL-1β, IL-1Rа с использованием коммерческих тест-систем ООО«Цитокин»(Россия)согласноинструкциямпроизводителей.Дляисследования сывороточной концентрации цитокинов проводили заборвенозной крови, асептически взятой путем венепункции из локтевой веныутром натощак в объеме 10 мл в пробирки с активатором свертывания.

Впоследующем кровь центрифугировали 15 минут при 200 g, отбиралинадосадочную жидкостьв чистые сухие пробирки типа «Eppendorf» изамораживали при температуре  30 оС. Хранили при температуре -4060 оСв холодильнике до 6 месяцев.2.2.5. Молекулярно-генетические исследованияНами были изучены частоты полиморфных маркеров rs386693509(CA/TC) гена CSF1R, rs3216780 (del/G) гена CSF1R, rs1800587 (C/T) гена IL1α, rs2234663 (2/4) гена IL-1Rа. Забор образцов жидкой крови осуществлялсяиз локтевой вены в пробирки типа «Vacutainer» с ЭДТА в объеме 23 мл.Образцы крови хранились до проведения исследования при температуре-20оС.

Выделение ДНК из образцов жидкой крови осуществляли наавтоматической станции для выделения нуклеиновых кислот и белковQIAcube с использованием набора реагентов QIAamp DNA Mini Kit(оборудование и реагенты производства QIAGEN, Германия). Образцывыделенной ДНК исследовали методом ПЦР по полиморфным маркерамгенов CSF1R, IL-1α и IL-1Rа.Амплификация исследуемых участков ДНКИспользованные пары праймеров представлены в таблице 2.2.

Дляполиморфного минисателлитного маркера IL1RN-VNTR была использованастандартная пара праймеров из работы J. K. Tarlow с соавторами [283]. Длялокусов CSF1R_64032 и IL1a-889 были использованы оригинальные парыпраймеров. Для подбора праймеров использовали Primer-BLAST [290] и48референтныенуклеотидныеNG_008850.1изБазыпоследовательностиданныхNCBI:NG_012303.1Nucleotideиdatabase(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/).Таблица 2.2Праймеры, использованные для энзиматической амплификацииисследуемых локусов№Локус1IL1RN-VNTR2CSF1R_640323IL1a-889Наименование праймера:Структура праймерапрямого (F) / обратного (R)IL1RN-VNTR-F5’-CTCAGCAACACTCCTAT-3’ЭнзиматическуюIL1RN-VNTR-R5’-TCCTGGTCTGCAGGTAA-3’CSF1R_64032-F5’-AAGAGGACAGGAGAGAGCGG-3’CSF1R_64032-R5’-TTGCAGGTACTCATGTGGCA-3’IL1a-889-F5’-GGTCACATACCAAACCAGGGA-3’IL1a-889-R5’-ACTCCAACTGGGAACCCAAAA-3’амплификациюпроводилиприпомощитермоциклеров Терцик (ДНК-технология) и T1 (Biometra) при 3035 циклахреакции, внося в реакционную смесь от 10 до 100 нг стартовой ДНК.Длявсехисследованныхлокусовпродуктыамплификациианализировали методом электрофореза в 1,52 % агарозных гелях.

Дляисследуемых образцов генотипы по маркеру IL1RN-VNTR определялисогласно инструкции производителя наборов «ТАПОТИЛИ».Для локусов CSF1R_64032 и IL1a-889 с целью последующегосеквенированияпродуктыамплификацииочищалиотизбыткадезоксинуклеотидтрифосфатов и праймеров на микроколонках QIAquick SpinColumns (Qiagen).Секвенирование исследуемых локусовСеквенирование амплифицированных участков локусов CSF1R_64032,IL1a-889 проводили в раздельных реакциях с помощью набора длясеквенирования DNA Sequencing Kit, BigDye Terminator Cycle Sequencing49ReadyверсииReaction3.1(AppliedBiosystems)сиспользованиемфлуоресцентно меченных дидезоксинуклеотидтрифосфатов и с одним изпраймеров с помощью термоциклера GeneAmp PCR System 9700 (AppliedBiosystems).

Продукты амплификации очищали с помощью набора BigDyeXTerminatorPurificationKit(AppliedBiosystems).Идентификациюампликонов осуществляли с помощью секвенатора 3500 Genetic Analyzer(Applied Biosystems).На завершающем этапе анализа нуклеотидных последовательностейдля исследуемых образцов использовали компьютерные программы ChromasLite (версия 2.1.1, Technelysium Pty Ltd), Sequence Scanner (версия 1.0,Applied Biosystems), PeakTrace Online (Nucleics), Vector NTI Advance 10(Invitrogen).

В качестве референтных нуклеотидных последовательностейиспользовали NG_012303.1 (для локуса CSF1R_64032) и NG_008850.1 (длялокуса IL1a-889).Обозначениявсехполиморфныхпозиций,установленныхдляисследованных образцов, проводили согласно Базе данных NCBI: dbSNP(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/).Полиморфные маркеры гена CSF1RВ гене CSF1R методом ПЦР с последующим секвенированием поСенгеру исследовали полиморфные маркеры rs3216780 и динуклеотидныйполиморфизм rs386693509 (в UTR-3 области гена). Амплификацию двухфрагментов гена CSF1R, содержащих целевые полиморфные локусы,проводилисиспользованиемподобранныхврамкахнастоящегоисследования праймеров в двух раздельных реакциях. Для подборапраймеровиспользовалиинтернет-ресурсPrimer-BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) и референтную нуклеотиднуюпоследовательностьNG_012303.1изБазыданныхNCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NG_012303.1).Размер амплифицируемыхфрагментов составлял около 1000 п.н.