Автореферат (Нарушение функции подоцитов и механизмов самозащиты почки - значение в оценке активности и прогноза хронического гломерулонефрита), страница 4

лимфоцитов (FoxP3-положительные ядра в 1,5 мм²40ткани почки)Методы статистической обработкиСтатистический анализ проводили с применением стандартных статистическихметодик с помощью программы STATISTICA 6,0 и SPSS 23. При описании данных клиниколабораторного обследования больных ХГН и изученных медиаторов, имеющих отличное отнормального распределение (не Гауссовское распределение), оценивали медиану иинтерквартильный размах [25; 75 процентили]. Для сравнений в 2 группах использовалинепараметрическийкритерийМанна-Уитни, множественныхсравнений- критерийВилкоксона.

Для выявления и оценки связей между исследуемыми показателями, применялинепараметрический метод ранговой корреляции. Достоверность различий частот в двухгруппах оценивали с помощью критерия 2 с поправкой Йетса. Для оценки прогностическогозначения показателей применен метод Каплан-Майер, достоверность различий оценена полог-ранговому критерию. Для оценки информативности изученных показателей применялиROC-анализ и рассчитывали площадь под кривой (AUC).16РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ1.

Показатели подоцитарного повреждения у больных ХГНУровень экскреции нефрина с мочой больных ХГННарушение функции подоцитов у больных ХГН было оценено по экскреции с мочойосновного белка щелевой диафрагмы нефрина. Уровень нефринурии у больных активнымиформами ХГН был выше (группа I и группа II), чем у больных с ремиссией заболевания(группа III) и у здоровых лиц, причем у больных с НС (группа II) он оказался значимо выше,чем у больных с умеренной ПУ (группа I). Наиболее высокий уровень отмечен у пациентов стяжелым НС (таблица 4). При этом у пациентов с НС и почечной дисфункцией показателинефринурии были достоверно выше, чем у пациентов с сохранной функцией почек.Различиямеждуморфологическимиформами,какпервичными«истинными»подоцитопатиями (болезнь минимальных изменений, ФСГС, мембранозная нефропатия), таки пролиферативными формами ХГН (МезПГН, МКГН) по показателю нефринурии былинедостоверны, решающую роль играла выраженность нефротического синдрома (рис.

2).Рисунок 2. Показатель нефринурии у больных с различными морфологическимиформами ХГН (n=94)Уровень подоцитурии у больных ХГННаряду с нефринурией у больных активными формами ХГН наблюдалась подоцитурия, какследствие отслойки от гломерулярной базальной мембраны и слущивания поврежденных17подоцитов в мочу, что прослежено на основании изучения методом цитофлоуметрии вмочевом осадке меченных антителами к подокаликсину (Pdx) подоцитов.

(рис. 3).Рисунок 3. Цитофлоуграммы мочи у больныхс различной активностью ХГНУ пациентов с (МС) (группа I) величина подоцитурии достоверно превышала этот показательу пациентов с неактивным течением нефрита (группа I). Наиболее высокий уровеньподоцитурии был отмечен у больных с НС (группа II) (таб. 4). Как и величина нефринурии,показатель подоцитурии коррелировал с выраженностью ПУ, гипоальбуминемии, а такжедлительностью персистирования НС, что свидетельствует о нарастающей со временемтяжести подоцитарного повреждения у больных с НС (таб.

5). В то же время достовернойсвязи подоцитурии с уровнем креатинина сыворотки крови, эритроцитурии и тяжестиартериальной гипертензии отмечено не было. Между показателями подоцитурии инефринурии отмечена тесная корреляция (Rs=0,9, p<0,05).18Таблица 4Показатели нефринурии и подоцитурии у больных ХГНГруппыПодоцитурия,Нефринурия,(pdx+кл/мкл)(нг/мл)100[0;0,6]7,9 [1,7; 9,5]235,45 [2,5;18,3]9,5 [7,6; 13](НС)3812,0 [7,0;35,0] 16,9 [10,9; 27,8] Умеренный НС288,0 [4,2;15,5]16,6 [10,45;27,3]Выраженный НС1036,5[9,0; 80,3]17,8[16,1;37,5]ХГН III группа205,4[1,0;9,43]7,25 [5,4; 9,8]nобследованныхбольныхЗдоровыеХГН I группа(с выраженным МС)ХГН II группа(неактивный) - p<0,05 по сравнению со здоровыми и I группой, p<0,01 по сравнению с I и II группойТаблица 5Взаимосвязь показателей подоцитарного повреждения - подоцитурии, нефринурии склинико-лабораторными признаками активности ХГНПоказательПодоцитурияНефринурияRs =0,23, p<0,05Rs =0,27, p<0,05Альбумин сыворотки крови, г/лRs=-0,38, p<0,001Rs=-0,27, p<0,05Эритроцитурия (выраженность)Rs=0,13, p=0,52Rs =-0,26, p<0,05Креатинин сыворотки, мг/длRs=0,09, p=0,56Rs=0,49, p<0,001АД сист.

мм рт. стRs= 0,22, Р=0,13Rs =-0,3, p<0,05АД диаст. мм рт. стRs= 0,27, Р=0,1Rs =-0,41, p<0,05Длительность НС, месRs= 0,42, Р<0,05Rs =0,4, p<0,05Протеинурия, г/сут19Уровень экскреции с мочой белка теплового шока 27 у больных ХГНУ больных ХГН с высокой ПУ (группы I, II) нами выявлено повышение в моче уровня БТШ27, как результат ослабления его функции в поддержании актинового цитоскелета ирегуляции формы ножек подоцитов – основы развития нефротической ПУ. Уровеньэкскреции БТШ-27 был наиболее высоким у больных с тяжелым НС (группа II), менеезначимым у больных с субнефротической ПУ (группа I), и мало отличимым от нормы убольных с ремиссией ХГН (группа III) (таб.

6).Таблица 6Уровень экскреции с мочой БТШ-27 у больных ХГН (n=84)показательБТШ-27 (нг/мл)группаIII.Здоровые (n=10)0,73 [0,66; 0,96]I. ХГН с МС (n=34)0,76 [0,68; 1,14]II.ХГН с НС (n=30)1,1 * [0,73; 1,83]НС умеренный (n=23)0,94 [0,71; 1,73]НС выраженный (n=7)1,88 *[0,8; 7,195]III. Неактивный ГН (n=10)0,72 [0,65; 0,98]Уровень нефринурии прямо коррелировал с выраженностью ПУ (Rs=0,297, p<0,05).Выявлены прямые достоверные корреляции между уровнем в моче БТШ-27, подоцитурией,нефринурией) у больных с НС (рис.4), что, с одной стороны, свидетельствует о значимостиэтих показателей как патогенетически связанных маркеров подоцитарной дисфункции иважного звена развития протеинурии, с другой стороны, о взаимодействии на территорииподоцита факторов повреждения и «системы самозащиты почки», одним из компонентовкоторой являются БТШ.БТШ 27Rs= 0,32; p<0,05Rs= 0,42; p<0,01ПОДОЦИТУРИЯНЕФРИНУРИЯRs= 0,9; p<0,05Рисунок 4.

Взаимосвязь показателей подоцитарного повреждения у больных ХГН с НС20Факторы апоптоза и выживаемости подоцитов в моче больных ХГНВажной составляющей механизма потери подоцитов и нарастания ПУ является усилениеапоптоза этих клеток, маркерами которого служит активация каскада внутриклеточныхкаспаз. При изучении уровня экскреции каспазы-9 с мочой больных активными формамиХГН было показано, что у пациентов с НС уровень каспазы-9 в моче значимо выше, чем убольных с МС (рис. 5).Рисунок 5. Экскреция каспазы-9 с мочой больных ХГНУровень каспазы-9 нарастал параллельно повышению уровня нефринурии и ПУ, чтоуказывает на вклад процессов апоптоза в подоцитарное повреждение, приводящее кразвитию ПУ у больных ХГН (рис. 6).Мы получили еще одно свидетельство снижения выживаемости подоцитов, на основанииизучения экскреции с мочой антиапоптотического фактора VEGF, который продуцируетсяподоцитами и по современным представлениям поддерживает функцию нефрина,способствуя сохранению целостности гломерулярного барьера.Уровень VEGF в моче был максимально высоким у больных с НС, но истощался приприсоединении почечной дисфункции, в то же время нефринурия продолжала нарастать,отражая тяжесть функциональных нарушений подоцитов (рис.

7).21Рисунок 6. Соотношение экскреции с мочой каспазы-9 и нефринау больных ХГНВеличина мочевого показателя VEGF у больных активным ХГН (группа I,II) с сохраннойфункцией почек прямо коррелировала с уровнем ПУ (Rs=0,673 p<0,0001), в то же время упациентов с прогрессирующим течением и нарушением функции почек степень сниженияVEGF прямо коррелировала с уровнем креатинина сыворотки крови (Rs=-0,31 p<0,05).У больных с активным прогрессирующим течением ХГН с нарушением функции почек,выявлялись и наиболее высокие показатели нефрина в моче (рис.6), при этом была полученаобратная корреляция между величиной экскреции с мочой VEGF и выраженностьюнефринурии (Rs=-0,8, p<0,05).Рисунок 7. Соотношение экскреции с мочой VEGF и нефрина у больных ХГН22Иммуногистохимическая оценка в биоптатах почки больных ХГНматриксной металлопротеиназы-9 и подоцитопенииПо современным представлениям экспрессия в клубочках почек ММП-9 отражает процессэпителиально-мезенхимальнойтрансдифференциацииподоцитов,способствующейихотслойке с базальной мембраны клубочка со слущиванием в мочу.

В нашем исследованиинаиболее высокая экспрессия ММП-9 в клубочках почек выявлялась у пациентов с НС, в тоже время уровень экспрессии ММП-9 в склерозированных клубочках был резко снижен (рис.8).Рисунок 8. Экспрессия ММП-9 в клубочках почек больных ХГНУ больных с активными формами ХГН увеличение экспрессии ММР-9 в почечныхклубочках сочеталось с высокими показателями нефринурии (рис 8), указывая на важнуюроль механизмов эпителиальной трансдифференциации в развитии подоцитопении в тканипочки.Прогрессирующая потеря подоцитов в клубочках почек была подтверждена намииммуногистохимическим методом с оценкой числа подоцитов, меченых по ядерномумаркеру антигену опухоли Вильмса (WT-1) (рис.9).23Рисунок 9.

Оценка выраженности подоцитопении по экспрессии WT-1у больных ХГНУстановлено, что количество экспрессирующих WT-1 ядер подоцитов у больныхактивным ХГН с НС было снижено (21 [16, 27,5] кл/срез клубочков) по сравнению сконтролем (44 [38; 47] кл/срез клубочка p<0,05) (рис. 9), что отражает уменьшение общегопула подоцитов в клубочках, наиболее выраженное у больных с тяжелым НС и почечнойдисфункцией (рис. 10).Рисунок 10. Исследование экспрессии WT-1 (степени подоцитопении)24в клубочках почек больных ХГНВыявлена обратная достовернаякорреляция между выраженностью подоцитопении ивеличиной подоцитурии (Rs = -0,35, p<0,05), которую в настоящее время рассматривают какдетерминанту гломерулосклероза (рис.

11).Рисунок 11. Корреляция между подоцитурией и показателем экспрессии WT-1 в тканипочкиМыразработалиматематическоеуравнение,позволяющеерассчитыватьстепеньподоцитопении на основании показателя подоцитурии, что может иметь практическоезначение для неинвазивного мониторирования процессов повреждения клубочков.Подоцитопения (%)=61,4727*exp(-0,0046*ПОД),где exp – экспонента; ПОД – показатель подоцитурии, выраженный в количествеэкспрессирующих подокаликсин клеток в 1 мкл осадка мочи (метод цитофлоуметрии).Согласно проведенному нами ROC-анализу подоцитурия более 20 кл/мкл осадка мочиявляется предиктором выраженной (более 50% от общего количества подоцитов в клубочке)подоцитопении и, соответственно, риска гломерулосклероза, и может использоваться вклинике для оценки прогноза ХГН (рис. 12).У больных с НС, не ответивших в течение 6 месяцев на проводимую стандартнуюиммуносупрессивную терапию, степень подоцитопении была более выражена (16 [14;20]кл/срез кл) и соответствовала более 50% потери подоцитов, чем у больных, достигших25ремиссии нефрита (30 [23;33] кл/срез кл) – около 31% потери общего числа подоцитов(p<0,05).Рисунок 12.

Информативность подоцитурии как маркера подоцитопении (площадь подкривой 0,748)Выявлена обратная достоверная корреляция выраженности экспрессии WT-1 в клубочках,отражающая степень подоцитопении, с величиной протеинурии (Rs = -0,35, p<0,05) иподоцитурии (Rs = -0,47, p<0,05)Можно сделать вывод о том, что для восстановления подоцитарного слоя гломерулярногофильтра и снижения протеинурии необходимо более активное и длительное лечение.Прогностическое значение исследованных показателей у больных ХГНВлияние подоцитарной дисфункции на характер течения ХГН наглядно прослеживалось прианализе эффекта иммуносупрессивной терапии: у больных с высоким исходным уровнемнефринурии (более 17нг/мл) и подоцитурии (более 20 кл/мкл) и низким уровнем VEGF(менее 124 нг/мл) ответ на терапию был значительно хуже.