Автореферат (Нарушение функции подоцитов и механизмов самозащиты почки - значение в оценке активности и прогноза хронического гломерулонефрита), страница 3

Диссертацияиллюстрирована 54 рисунками, 15 таблицами, содержит 5 клинических наблюдений.СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИМатериалы и методы исследованияОбщая характеристика обследованных больныхОбследовано 159 больных ХГН, клинически протекающего преимущественно с ПУ иНС (протеинурические формы ХГН): 73 женщины (45,9%) и 86 мужчин (54,1%) в возрасте от16 до 74 лет (в среднем 35,0 [25-50] лет), наблюдавшихся в клинике нефрологии, внутреннихи профессиональных болезней им. Е.М.

Тареева, Университетская клиническая больница №3ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (СеченовскийУниверситет) с 2006 по 2016 годы.10У 105 пациентов (66%) с ХГН диагноз был подтвержден морфологически. У 53больныхобнаруженаморфологическаякартина,характернаядляистинныхпротеинурических форм хронического гломерулонефита: у 21 – мембранозная нефропатия(МН), у 4 – нефрит с минимальными изменениями (МИ), у 9 – фокально-сегментарныйгломерулосклероз (ФСГС); у 19 – мезангиокапиллярный ГН (МКГН). У 41 больного выявленмезангиопролиферативный ГН (МПГН) и у 11 – нефросклероз в исходе гломерулонефрита.Результаты исследования молекулярных медиаторов сравнивали в группах больных,различающихся по степени активности ХГН.

Клинико-лабораторная характеристикаобследованных больных ХГН приведена в таб. 1.Группу I составили 57 пациентов с выраженным мочевым синдромом (МС): у 41больного МС развился в дебюте и персистировал в среднем в течение последующих 4 [2;7]месяцев до исследования, у 16 больных после дебюта заболевания с НС в дальнейшем ХГНпротекал с МС. Клинически больные I группы характеризовались ПУ субнефротическогоуровня без биохимических признаков НС; у 33 из 57 больных ПУ сочеталась с малой илиумеренной эритроцитурией.Артериальная гипертензия (САД от 150 до 190 мм рт. ст., ДАД от 100 до 110 мм рт.

ст.)выявлялась у 15 больных. Уровень креатинина и СКФ в среднем по группе были в пределахнормы.В группу II включен 71 больной с НС различной выраженности: у 24 больных отмечалсятяжелый НС с протеинурией от 6,0 до 20,0 г/сут, гипоальбуминемией от 16,8 до 20,5 г/л,периферическими отеками до степени анасарки, наличием полостных отеков.У 25 больных этой группы НС сопровождался почечной дисфункцией (повышениекреатинина сыворотки крови от 1,27 мг/дл до 3,28 мг/дл (1,94 [1,4;2,42] мг/дл, снижениеСКФ 42 [30;50] мл/мин), что соответствует хронической болезни почек (ХБП) 3 стадии, у 13из них с наиболее активным течением ХГН НС сочетался с остронефритическим синдромом(ОНС) (эритроцитурия от 20 до 100 в п.зр., САД от 150 до 200 мм рт.

ст, ДАД от 100 до 120 мрт. ст., с нарушением функции почек (креатинин от 1,37 до 3,28 мг/дл, СКФ – от 26 до 56мл/мин)Группу III составил31 больной с неактивным нефритом: из них 9 – с ремиссиейнефротической формы ХГН после успешной иммуносупрессивной терапии. У больных этойгруппы выявлялась небольшая ПУ, у 16 из них – изолированная, у 15 – в сочетании сминимальной или умеренной эритроцитурией (в среднем 6 [1;20] в п.зр.). Артериальнаягипертония (САД от 140 до 170 мм рт. ст., ДАД от 95мм рт. ст. до 100 мм рт. ст.) отмечаласьу 10 больных.

Функция почек у 20 больных была сохранна, у 11 отмечались признаки11почечной дисфункции: СКФ (48 [36;66] мл/мин), креатинин сыворотки крови 1,7 [1,32; 2,26]мг/дл, что соответствует ХБП 2-3 стадии.Таблица 1Клиническая характеристика обследованных больных ХГН(n=159)ГруппаПоказателиСуточная ПУ(г/сут)Эритроцитурияв п.зр.Альбуминсыворотки(г/л)Общий белоксыворотки(г/л)Креатининсыворотки(мг/дл)СКФ(по Ребергу)(мл/мин)АД сист.(мм рт.ст.)АД диаст.(мм рт.ст.)I группа(МС)n=57II группа(НС в целом)n=71УмеренныйНСn=47выраженныйНСn=241,9 [1,4;3,2]5,54 [3,4;7,9]10,0 [7,3;16,0]6 [3;25]6,12[4,37;10,0]8 [2;30]5[2,11]8[3;16]III группа(неактивный ХГН)n=310,48[0,157;0,78]6 [1;15]39,8[37,5; 42,4]25,6 [21,3;30,7]28,7[25,0; 31,0]19,0[17,5; 20,0]43,8[41,2; 46,1]63,2[59,7;68,7]43,9[39,2; 50,6]46,9[42,5; 51,6]37,9[33,6; 37,7]67,8[65,2; 71,9]1,1[0,85; 1,65]1,06[0,8; 1,5]1,0[0,72; 1,4]1,25[0,9; 1,93]1,03[0,84; 1,5]87,3[55,0;114,5]130,0[125,0;140,0]80,0[80,0; 90,0]90,0[60,0;117,0]135,0[120,0; 160,0]101,0[76,0; 134,0]65,3[43,0; 98,8]76,0[55,0; 116,0]140,0[120,0; 160,0]135,0[130,0; 150,0]90,0[80,0; 100,0]90,0[80,0; 100,0]82,5[80,0; 90,0]120,0[120,0;135,0]80,0[80,0; 90,0]В группу контроля вошли 20 практически здоровых лиц (10 женщин и 10 мужчин) от20 до 41 года (в среднем 31 [28 -37] лет) без протеинурии, нормальным артериальнымдавлением и сохранной почечной функцией.У 37 пациентов с активным ХГН был проанализирован характер течения заболеванияи ответ на стандартную иммуносупрессивную терапию преднизолоном и цитостатиками втечение ближайшего года наблюдения в зависимости от исходной величины изученныхмолекулярных медиаторов моче и сыворотке крови.

При проведении иммуносупрессивнойтерапии оценивали наличие/отсутствие ответа и сроки достижения ремиссии заболевания.Ответом на проводимую имуносупрессивную терапию считали уменьшение протеинуриименее 0,3г/сут. со стабильной функцией почек или уменьшение протеинурии на 50% и более12от исходной (с нормализацией белков сыворотки крови – купирование нефротическогосиндрома) при условии улучшения или сохранения стабильной функции почек.Оценка антипротеинурического действия препарата, блокирующего эффекты МСР-1, убольных с ХГНОтобраны 7 больных с ХГН (1 с МКГН, 1 – МН, 1 – МИ, 1- ФСГС, 2 – МезПГН; 1женщина и 6 мужчин в возрасте 31 [24; 57] года) с активным течением ХГН, у которыхвозможно было отсрочить патогенетическое лечение кортикостероидами и цитостатиками на3 месяца без высокой вероятности ухудшения.У 4-х больных с выраженным мочевым синдромом уровень суточной ПУ в среднемсоставлял 2,03 [1,48; 3,92] г/сут, у одного больного ПУ сочеталась с выраженнойэритроцитурией (до 100 в п/зр.), у 3-х – с умеренной эритроцитурией (до 20 в п/зр).

У 3-хбольных отмечалось начальное снижение функции почек (креатинин в среднем 1,27 [1,17;1,54] мг/дл, СКФ 62-74 мл/мин). У 2 - умеренная артериальная гипертензия (АД до 160/100мм рт.ст.).У 3 больных отмечался умеренный нефротический синдром (НС): протеинуриясоставляла в среднем 2,5 [2,46; 5,28] г/сут, альбумин 29 [27,6; 30] г/л, у двух больных НСсочетался с умеренной эритроцитурией до 20 в п/зр. Функция почек у этих больных быласохранна: креатинин 0,68 [0,64; 0,72] мг/дл, СКФрасч. по CKD-EPI 100-140 мл/мин). У всехбольных отмечалась умеренная артериальная гипертензия (АД до 150/100 мм рт.ст.).У этих больных был применен разработанный в ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ препарат,представляющий собой пептид Х молекулы МСР-1(65-76 МСР-1), который блокируетэффекты МСР-1 путем связвывания гликозаминогликанов на поверхности клеток иконкурентного вытеснения эндогенного МСР-1 и, возможно, других хемокинов, благодарячему осуществляется противовоспалительное действие и протективное влияние на подоциты(одобрено МЗРФ разрешением N720 от 16.02.2012г, Советом по этике при Министерствездравоохранения и социального развития России N 34 от 08.02.2012г., Межвузовскимкомитетом по этике, протокол N02-12 от 16.02.2012г.)Применена следующая схема (рис.1): в первую неделю лечения - 6 инъекций по 2,5мг синтервалами 6 ч между двумя первыми, 24 ч - между последующими двумя, 48 ч - междупятой и шестой инъекциями.

Первые 2 инъекции выполнялись внутривенно, остальные 4 –внутримышечно (суммарная доза – 15мг).У 6-ти больных каждые четыре недели курсы лечения повторяли, всего им проведено 3полных курса. У одного больного в связи с нарастанием НС после однократного курса13леченияна21суткибыланачатастандартнаяиммуносупрессивнаятерапияглюкокортикостероидами и циклофосфамидом.Рисунок 1. Схема введения препарата, блокирующего эффекты МСР-1Специальные методы исследованияНаряду с общеклиническим обследованием, принятым для нефрологических больных,были применены специальные методы исследования.В моче больных ХГН, включенных в исследование, методом непрямогоиммуноферментного анализа (ИФА) были определены:-Основной белок межподоцитарной щелевой диафрагмы - нефрин,-Провоспалительные факторы: моноцитарный хемотаксический протеин-1 и интерлейкин-6,Фактор апоптоза подоцитов - каспаза-9Показатели, отражающие функционирование «системы самозащиты почки»:Белки теплового шока-27 и 70 (внутриклеточные протективные белки, действие которыхнаправлено на восстановление структуры и функции клеток в процессе повреждения)Фактор выживаемости подоцитов - сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF)Противовоспалительные цитокины - интерлейкин -10, антагонист рецептора ИЛ-1 (ИЛ-1ра).Компоненты протеолитической системы - Матриксные металлопротеиназы -2 и -9,тканевой ингибитор матриксной металлопротеиназы-2В моче методом цитофлоуметрии изучен показатель подоцитурии (наличие подоцитов иих фрагментов в моче, результат отслоения и слущивания подоцитов от гломерулярнойбазальной мембраны)В сыворотке крови методом ELISA был исследован уровень:- АТ к БТШ-70 (отражающих активацию противовоспалительных механизмов в ответ наэкспрессию БТШ70 клетками в очагах повреждения/воспаления).В ткани почек 40 больных ХГН иммуногистохимическим пероксидазнымметодом была изучена экспрессия:-белок Wilms tumor- 1 (WT-1) (маркер ядер подоцитов)14-белок теплового шока-70;-FoxP3 (транскрипционный фактор Т-регуляторных клеток, используемый в качествемаркера этих клеток).- матриксная металлопротеиназа-9Экспрессия БТШ-70 и матриксной металлопротеиназы-9 в ткани почки была оцененаполуколичественно (в баллах) иммуногистохимическим пероксидазным методом.Морфометрическим методом проведен подсчет противовоспалительных Т-клеток,меченых FoxP3, и количества подоцитов по ядерному маркеру антигена опухоли Вильмса-1(WT-1).

С помощью морфометрического подсчета (FoxP3+) ядер было определено числопротивовоспалительных клеток в интерстициальной ткани почки (в корковом слое научастке 1,5 мм2).Спектр изученных мочевых, сывороточных и тканевых показателей и методы ихопределения представлены в таб. 2 и 3.Таблица 2Молекулярные медиаторы в моче и сыворотке больных ХГН и методы их определенияИзученные показателиМетод определения, наборы реактивов дляисследованияКоличествобольныхХГННефринурия (моча)ELISA (Uscnc Life Science Inc. Wuhan, China)74Подоциты(моча)33ИЛ-1ра (моча)Метод проточной цитофлоуметрии,(мышиные антитела к подокаликсину,Abcam, Великобритания)ELISA (BioSource International, ImmunoassayKit, США, Бельгия)ELISA (BenderMedsystems, Австрия)VEGF-А (моча)ELISA (BenderMedsystems, Австрия)80Каспаза-9 (моча)ELISA (BenderMedsystems, Австрия)78ELISA (Enzo, США)84ELISA (Enzo, США)84ELISA (Enzo, США)84ИЛ-6 (моча)ELISA (Invitrogen, США)84ИЛ-10 (моча)ELISA (eBiosciеnce, Австрия)84ELISA (R&D Systems Quantikine, США)77ELISA (R&D Systems Quantikine, США)77(подоцитурия)МСР-1 (моча)БТШ-70 (моча)Антителак(сыворотка)БТШ-27 (моча)Металлопротеиназы(моча)ТИМП-2БТШ70-2156380Таблица 3Показатели, изученные в ткани почки больных ХГНИзученные медиаторыМетод определения, наборы реактивовКоличестводля исследованиябольных ХГНИммуногистохимическое исследованиеБТШ-70«SpringBioscience» (США)40FoxP3«SpringBioscience» (США)40ММП-9«Daco», Дания55Морфометрическое исследованиеКоличество WT-1 позитивных ядер в клубочке40Kоличество Т-рег.