Диссертация (Влияние структуры агликона на иммунотропную активность гликозидов мурамилдипептида), страница 6

Подтверждением этомуявляется потеря соединениями иммуноторопности при введении в аномерныйцентр паминофенильной группы. В то же время присоединение неактивного35p-аминофенил β-гликозида к глюталальдегиду приводит к частичномувосстановлению иммунотропности полученного олигомера.

Более того,данный олигомер превосходил немодифицированный МДП по способностизащищать экспериментальных животных от инфекционных заболеваний [200].Эксперименты in vivo показали, что степень липофильности агликонаспособна оказывать влияние на биологическую активность производных МДПпутем увеличения адъювантной активности и снижения пирогенности [101].Примером манипуляции с липофильностью соединений является введениеперфторалкильной группы в аномерное положение глюкойдного участка [52].3.3.6.

Амфифильность β-гликозидов МДП как фактор повышения ихбиологической активностиβ-гликозиды МДП стали объектом интереса для отечественнойиммунологии и фармакологии в начале 90-х годов XX века, когда былипроведены первые работы по изучению их иммунотропной активности набазовых иммунологических моделях. В ходе данных экспериментов былавыявлена значимая иммунотропная активность производных МДП, сравнимаяили превышающая таковую у немодифицированного МДП [8, 11].Обнадеживающие результаты первых серий исследований подтолкнулинаучный коллектив во главе с О.В. Калюжиным к расширению спектра работкак по поиску наиболее активного β-гликозида МДП, так и по попыткеобъяснить более высокую активность данной группы соединений посравнению со сходными α-гликозидами МДП.

Серии экспериментов,проведенных in vitro указывали на то, что степень липофильности соединенийвлияет на биологическую активность гликозидов МДП и подтвердили, чтоамфифильные β-гликозиды МДП обладают биологической активностью,превышающую таковую у их липофильных аналогов [3, 5].В ходе последовавших серий экспериментов среди изучаемыхсоединений было отобрано соединение, наиболее подходящее для внедренияв клиническую практику. Таким соединением оказался β-гептилгликозидМДП, использовавшийся опредленный период времени на практике в качестве36биологической активной добавки к пище под коммерческим названиемГлимурид [5]. Первоначальной сферой применения данного препарата сталанеспецифическаястимуляцияиммунногоответаприхроническихинфекционных заболеваниях.

Достоинством β-гептилгликозида МДП посравнению с другими соединениями данной группы является легкость синтеза,что позволяет снизить расходы при массовом производстве и таким образомснизить цену готового препарата при коммерческой продаже [4].Одновременносначаломклиническихисследованийэтогоиммуномодулятора продолжилось более подробное изучение свойств новыхпроизводных МДП с применением различных экспериментальных моделей.Проведена серия исследований на предмет изучения активности βгептилгликозида МДП in vivo на модели лимфомы EL-4 у мышей [7].Исследования на моделях in vivo показали наличие противоопухолевогоэффекта введения препарата животным-опухоленосителям.Доказана перспективность применения β-гептилгликозида МДП дляпрофилактики инфекционных осложнений у онкологических больных [25].Использование Глимурида у больных хроническим описторхозомпозволило снизить выраженность иммунных расстройств после проведеннойдегельминтизации.

Глимурид также явился эффективным средством длятерапии клинических проявлений резидуального описторхоза [6].Анализ опыта клинического применения Глимурида говорит опотенциале β-гликозидов МДП как средств патогенетического леченияперсиcтирующих инфекций [22].β-ГликозидыМДПрассмотренывкачествеиндукторовиммунозависимых абортов у мышей. Введение гликозидов МДП достоверноувеличивало частоту резорбции эмбрионов у животных [2].Изучено влияние β-гептилгликозида МДП на продукцию цитокиновспленоцитами мышей ex vivo [26]. Также определено влияние βгептилгликозида МДП на пролиферацию спленоцитов, тимоцитов у мышей синдуцированным гепатитом. Внутрибрюшинное введение гликозида МДП37уменьшалораспространенностьнекрозагепатоцитовсподавлениемпролиферации тимоцитов на третьи сутки и с ее последующим усилением наседьмые сутки.

Введение препарата не вызвало значимого измененияпролиферации спленоцитов у животных [37].Остаются недостаточно изученными биологические эффекты βгликозидовМДПиммуномодулятораinvivo.наТак,открытдинамикувопросоконцентрациивлияниипро-этогоипротивовоспалительных цитокинов в сыворотке крови лабораторныхживотных. Большая часть экспериментов in vitro осуществлена с применениемклеточных культур мышей, но не человека.

Действие β-гликозидов МДП наэкспрессию дендритными клетками маркеров созревания и активации ранее неоценивалось.38МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ1. Материально-техническое обеспечение работыХарактеристика исследуемых соединенийИсследуемыеβ-гептил-,β-децил-,β-додецил-,β-адамантил-,β-циклогексил-, β-циклооктил- и β-циклодецилгликозиды МДП, а также МДПсинтезированыилюбезнопредоставленызаведующимкафедройорганической и биологической химии факультета биологии и химииТаврической академии ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университетимени В.И. Вернадского».Общая структура β-гликозидов МДП представлена на рисунке 1.Примечание: R – агликонРисунок 1.

Структура β-гликозидов МДПСтруктура агликонов и молекулярный вес изучаемых веществпредставлены в таблице 1.39Таблица 1Характеристика исследованных β-гликозидов МДПНазваниеСтроение агликонаМолекулярный вес(Да)Гептилгликозид МДП590Децилгликозид МДП632Додецилгликозид МДП660HАдамантилгликозидМДП640МДПHHЦиклогексилгликозид574МДПЦиклоктилгликозид602МДПЦиклодецилгликозидМДП630МДП40Клеточные линииВ работе были использованы клетки эритролейкемии человека линииК562 полученные из банка клеточных линий ФГБУ «Национальныймедицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н.

Блохина»Минздрава России. Все клеточные культуры культивировались в среде RPMI1640 с добавлением 2 мМ L-глутамина, 25000 ЕД стрептомицина,пенициллина с добавлением фетальной телячьей сыворотки в концентрации10% (полная питательная среда – ППС), в условиях поддержанияконцентрации атмосферного СО2 равной 5 %, абсолютной влажностиатмосферы 10% и температуры 370С ± 0,50С.Лабораторные животныеВ работе были использованы половозрелые самцы мышей линииC57Bl/6 и CBA массой тела 18-22 г, полученные в филиале "Столбовая"Федерального государственного бюджетного учреждения науки "Научногоцентра биомедицинских технологий Федерального медико-биологическогоагентства".Экспериментальных животных содержали на стандартном пищевомрационе брикетированных экструзированных кормов, со свободным доступомк корму и питьевой воде.Манипуляции с лабораторными животными проводили в соответствии смеждународными рекомендациями по проведению медико-биологическихисследований с использованием животных, изложенными в Европейскойконвенциипозащитепозвоночныхживотных,используемыхдляэкспериментальных и научных целей ЕЭС (Страсбург,1985), руководствуясьтребованиямиХельсинскойдекларациииВсемирноймедицинскойассоциации (2000), а также рекомендациями, содержащимися в ДирективахЕвропейского сообщества (86/609 ЕС), Приложении к приказу министраздравоохранения СССР №755 от 12.08.1977, Приказом Минсельхоза РФ №490от05.11.2008«Обутвержденииправилпроведениялабораторныхисследований в области ветеринарии» и Национальным Стандартом41Российской Федерации «Принципы надлежащей лабораторной практики»(ГОСТ Р 53434-2009).Использованные химические реактивы и наборыВ экспериментальной части работы применяли следующие материалы:Азур-Эозин для окрашивания по Романовскому («МиниМед», Украина),метиленовый синий для окрашивания по Май-Грюнвальду («МиниМед»,Украина), формальдегид («ХимМед», Россия), 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил4]2,5дифенилтетразолиум бромид (MTT) («ПанЭко», Россия), среда RPMI-1640(Sigma) c 25 мМ HEPES («ПанЭко», Россия), раствор Хенкса («ПанЭко»,Россия), сыворотка крови телячья эмбриональная («ПанЭко», Россия), растворфикола-урографина ρ=1,077 г/см3 («ПанЭко», Россия), таблетки дляприготовления фосфатно-солевого буфера, рН=7.4 («ПанЭко», Россия),глутамин натрия («ПанЭко», Россия), пеницилин (25 000 ЕД) («ПанЭко»,Россия), стрептомицин (25 000 мг) («ПанЭко», Россия), NaCl 0,9%(физиологический раствор) (ООО «Гемотек», Россия), латекс для фагоцитоза1,5 мкм 10 мл («ПанЭко», Россия), нитросиний тетразолий (НСТ) («MERCK»,Германия), диметилсульфоксид (ДМСО) («ПанЭко», Россия), антитела к CD1a,CD40, CD80, CD83, CD86, CD14, HLA-DR («Becton Dickinson», США, и«Beckman Coulter», США), Flow Cytomix Mouse Th1/Th2 10 plex Kit («BenderMedSystems», Австрия).Использованное оборудование и расходные материалыПри выполнении работы были использованы нижеперечисленные видыаналитического и лабораторного оборудования и инструментов: центрифуга(«Jouan», Франция), пластиковые пробирки 14 мл и 50 мл («Termo Scientific»,США), матраcы для культивирования клеточных культур («SPL», США), СО2–инкубатор («NuAire», США), автоматические дозаторы фиксированного ипеременногообъема(«BIOHIT»,Финляндия),весылабораторныеэлектронные («Adventure Pro AV 264C ohaus corp», США) камера Горяева(«МиниМед», Украина), термостатический шейкер («ELMI», США), фотометр(«Labsystems Multiskan MS original», Финляндия), световой микроскоп42(«ZEISS», Германия), предметные стекла («Menzel», Германия) 96-луночныепланшеты («Corning Costar», США), проточный цитофлюориметр BD Canto II(«Becton Dickinson», США), центрифуга Eppendorf Centrifuge 5415 R(«Eppendorf», США), виалы («ПанЭко», Россия), микропоровые фильтры («GEInfrastructure», США)2.

Методы экспериментальных исследованийВыделение МНК из периферической кровиДля получения МНК осуществляли забор периферической кровиздоровых доноров. Образцы крови вносили в гепаринизированные пробирки сдобавлением раствора Хэнкса в соотношении 1:1.Разбавленную таким образом кровь наносили в виде кольца на фиколурографин с ρ=1,077 г/мл, ранее внесенный в пластиковые пробирки c V=15мл. Образцы центрифугировали в течение 20 мин при 350 G до разделенияобразцов на фракции.Взвешенные МНК выделяли из интерфазного кольца образцов ипереносили в новую емкость для отмывания от фикола-урографина.Отмывание проводили путем трехкратного разведения суспензии растворомХэнкса и последующего центрифугирования в течение 5 минут при 300 G судалением надосадочной жидкости на каждом этапе.Подсчет количества МНК проводили в камере Горяева.