Диссертация (1139917), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Для определенияжизнеспособности клеток применяли предварительное окрашивание каждогоисследуемого образца равным объемом 0,1%-ного трипанового синего,окрашивающего погибшие клетки.Клетки культивировали в пластиковых планшетах в полной среде RPMI1640.Колориметрическийметодопределенияцитотоксическойактивности NK-клетокВ качестве клеток эффекторов (КЭ) использовали МНК, выделенные из43крови здоровых доноров. В качестве клеток-мишеней (КМ) использоваликлетки эритролейкемии человека линии K562. Для контроля стерильностииспользуемой среды использовали свободные лунки планшета с добавленнымв них 200 мкл полной питательной среды RPMI-1640.
При исследованиицитотоксической реакции в каждую лунку 96-луночного планшета добавлялипо 100 мкл суспензии клеток-эффекторов и по 100 мкл суспензии клетокмишеней. Соотношение КМ к КЭ составляло 1:5. В группе референс-контролярассматриваласьцитотоксичностьКЭ,коинкубированныхснемодифицированным МДП. В качестве группы контроля рассматриваласьцитоксичность интактных КЭ.Коинкубацию клеток эффекторов и клеток мишеней проводили течение24 ч, в условиях поддержания концентрации атмосферного СО2 на уровне 5 %,абсолютной влажности атмосферы 10% и температуры 37±0,50С в CO2инкубаторе (Jouan). При завершении срока коинкубации в лунки добавляли по20 мкл 5% раствора МТТ, с последующей инкубацией планшета в тех жеусловиях на протяжении 180-240 минут до выпадения кристалловвосстановленного МТТ (рис. 3).После визуальной верификации наличия выпадения кристалловформазана, удаляли супернатант с последующим добавлением 150 мкл ДМСО.Через 30 минут инкубации при температуре 200С проводили определениеоптической плотности на спектрофотометре Labsystems Multiskan MS original»(Финляндия) при λ=540 нм.Цитотоксичность выражали цитотоксическим индексом в процентах иопределяли по формуле:ИЦА=[(1-(ОПкэ+км+ОПкэ)/ОПкм) х 100%]где ОПкэ+км – оптическая плотность МТТ-тетразолия в лунках,содержащих КЭ и КМ, ОПкэ – оптическая плотность в лунках с наличиемтолько КЭ, ОПкэ – оптическая плотность в лунках с наличием только КМ.44Определение влияния исследуемых соединений на фагоцитарнуюактивность нейтрофилов крови человекаФагоцитарнуюактивностьнейтрофиловкровидонора,коинкубированных с исследуемыми соединениями, определяли по методикеГордиенко Г.И.
(1984) с некоторыми изменениями. В качестве источниканейтрофилов была использована кровь здорового донора. В стерильные виалывносили гепаринизированную кровь в объеме, равном 150 мкл, суспензиючастиц латекса с диаметром 1,5 мкм и стерильные водные растворыисследуемых гликозидов в концентрации равной 1˟10 -5 моль/л в объеме 1-5мкл.
Коинкубацию проводили в течение 40 мин при 37 0С с использованиемшейкера. После коинкубации ресуспендировали каждый образец и забиралипо 4 мкл крови из каждой виалы с последующим нанесением напредварительное обезжиренное предметное стекло с формированием мазка.Окрашивание образцов по методике Романовского-Гимза проводили послеиспарения жидкости. Подсчет фагоцитирующих клеток проводили в световоммикроскопе под иммерсией. Подсчет исследуемых показателей проводился на100 клеток каждого образца. Фагоцитарная активность была вычислена какпроцент фагоцитирующих нейтрофильных гранулоцитов от общего числаобнаруженных клеток; Фагоцитарное число было вычислено как среднееколичество частиц, захваченных одной клеткой.Получение и активация дендритных клеток человекаДендритные клетки получали по стандартной методике (Romani N.1994.).МНК выделяли из донорской крови по методике, описанной выше.Полученные МНК после их осаждения и концентрирования путемцентрифугирования инкубировали в течение 18 часов в полной среде в CO2инкубаторе (Joan) при 370С в атмосфере 5% СО2.
После инкубации проводилимеханическое удаление неприлипающих клеток и отмывание теплой средойRPMI-1640. В среду добавляли человеческий рекомбинантный ИЛ-4 додостижения рабочей концентрации 10 нг/мл (200 U/мл) и ГМ-КСФ до45достижения концентрации 10 нг/мл (500 U/мл).Последующую инкубацию проводили в течение 6 суток в полной средес добавлением половинной дозы цитокинов (1 раз в 72 часа) и заменой средыи факторов созревания по мере необходимости.Фенотипический анализ влияния гептилгдикозида МДП насозревание ДК человекаЗа 48 часов до анализа в матрасы с созревшими ДК добавлялигептигликозид МДП до достижения концентрации 10 мкмоль/мл. В качествереференс-контроля использовали немодифицированный МДП в такой жеконцентрации.
В качестве контроля использовали интактные ДК.Вцитофлюориметрическиепробиркивносилипо4мклсоответствующих меченых флуорохромами антител к CD1а, CD40, CD80,CD83, CD86, CD14, HLA-DR. Функциональное значение этих фенотипическихмаркеров ДК представлено в табл. 2.Таблица 2Функциональное значение фенотипических маркеров ДКМембранный антиген ДК Функция/значение фенотипического маркераCD1aПрезентация антигена Т-клеткамCD40Костимулирующая молекулаантигенпредставляющих клетокCD80Костимулирующая молекулаантигенпредставляющих клетокHLA-DRMHC II класса, участие в презентации антигенаCD83Маркер терминальной дифференцировки(зрелости) дендритных клетокCD86Костимулирующая молекулаантигенпредставляющих клетокCD14Рецептор ЛПС46Вкачествекрасителейиспользоваликомбинациифлюоресцеинизотиоцината (FITC) и фикоэритрина (PE),После внесения антител в пробирки добавляли суспензию ДК человекав объеме 50 мкл, полученные вышеописанным методом.
Каждый образецподвергали ресуспендированию и инкубировали в течение 30 мин прикомнатной температуре в темноте. По завершению инкубации, в каждуюпробирку было добавлено по 450 мкл фиксирующего раствора (1 %формальдегид в пара-бензоальдегиде). Пробирки с образцами хранили притемпературе -100С. Уровень экспрессии клетками исследуемых маркеровоценивали с использованием цитофлюориметра BD Canto II, не позднее чемна 7 сутки после нанесения меченных антител.Вкаждомобразцеанализировалинеменее10000событий.Исследование особенностей фенотипа проводили после предварительногогейтирования лейкоцитов на точечной иммуноцитограмме CD45+-клеток (рис.2). Следует отметить, что в каждом образце CD45+-клеток составляло не менее95-98 %.Рисунок2.Гейтированиелейкоцитов(CD45+)наточечнойиммуноцитограммеа) по сигналам SSC/FSC, б) по сигналам SSC/CD45: FSC-A соответствуетпрямомусветорассеянию(осьх),SSC-Aсоответствуетбоковомусветорассеянию (ось у), CD45+ соответствует интенсивности флюоресценции(MFI) данного флюорохрома (ось х).47Для определения негативной или позитивной экспрессии антигенаклеткамивкаждомслучаеиспользовалсянегативныйконтрольсизотипическими мышиными антителами IgG1/IgG2/ IgG3/CD45.
При этомнемеченые клетки находились в пределах третьей декады (рис. 3).Рисунок3.Гистограммараспределениянемеченыхклетокпериферической кровиАнализ результатов проводили в программе Win MDI 2.8 for Windows 7(США).Уровень экспрессии антигена выражали в виде доли клеток,экспрессирующих исследуемый маркер, в общей популяции клеток (%).Флуоресцентнаямикроскопиямононуклеарныхлейкоцитовчеловека с использованием окрашивания моноклональными антителамиЗа 48 часов до микроскопии в матрасы с ДК добавляли гептигликозидМДП до достижения концентрации 10 мкмоль/мл.
В качестве референсконтроля использовали немодифицированный МДП в такой же концентрации.48В качестве контроля использовали интактные ДК.КполученнымвышеуказаннымспособомДКдобавлялимоноклональные антитела к человеческим CD14, CD80, HLA-DR додостижения концентрации 10 мкг/мл. После 30 минут инкубации в атмосфере5% СО2 при температуре равной 37°С было проведено микроскопирование сиспользованием системы Axiovision.Изучениевлиянияисследуемыхвеществнаконцентрациюцитокинов в сыворотке крови мышей линии C57BL/6Животным линии C57BL/6 внутрибрюшинно вводили по 10 мкг βгептилгликозидаМДПв100мклфизиологическогораствора(экспериментальная группа).
В качестве референс-контроля использовалигруппу животных с внутрибрюшинным введением 10 мкг МДП в 100 мклфизиологического раствора. В качестве контроля использовали группу свведением внутрибрюшинно 100 мкл физиологического раствора. Забор кровиживотных производился через 1 час, 8 часов и 24 часа после введенияпрепаратов. Образцы центрифугировали в течение 10 мин при 350 G, затемпроизводили отделение сыворотки крови с последующим измерением уровняцитокинов при помощи системы FlowCytomix на проточном цитометресогласно инструкции производителя.Изучение влияния β-гептилгликозида МДП на динамику роста иметастазирования меланомы B16 и продолжительность жизни мышейопухоленосителейИсследование было проведено на 160 половозрелых мышах, самцахлинии С57Bl/6, массой тела 18-22 г. Животных содержали на стандартномпищевом рационе, со свободным доступом к корму и питьевой воде.Меланому B16 трансплантировали животным подкожно в область боковойповерхности грудной клетки.
В опытах использовали 5-й пассаж опухоли invivo. Трансплантацию опухолевой ткани осуществляли путем введениясуспензии клеток меланомы В16 в количестве 1×105 клеток в 0,1 млпитательной среды 199.49β-Гептилгликозид МДП вводили внутрибрюшинно в дозах 1 мкг; 5 мкг;25 мкг на животное в 2 режимах (профилактический и терапевтический):-однократноевведениеза24часадоперевивкиопухоли(профилактический режим);- введение через 24, 48 и 72 часов после перевивки опухоли, затем одинраз каждые трое суток до гибели животных (терапевтический режим).В исследование были включены следующие группы по 20 животных:1. Контрольная №1 (интактным животным вводился физиологическийраствор);2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
