Диссертация (Разработка методик совместного количественного определения лекарственных веществ - субстратов-маркеров различных изоферментов цитохрома P450 методом LC-MS-MS)

Министерство здравоохранения Российской ФедерацииФедеральное государственное автономное образовательное учреждениевысшего образованияПервый Московский Государственный Медицинский Университетимени И.М. Сеченова (Сеченовский университет)На правах рукописиЕгоренковЕвгений АндреевичРАЗРАБОТКА МЕТОДИК СОВМЕСТНОГО КОЛИЧЕСТВЕННОГООПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ – СУБСТРАТОВ-МАРКЕРОВРАЗЛИЧНЫХ ИЗОФЕРМЕНТОВ ЦИТОХРОМА P450 МЕТОДОМ LC-MS/MS14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозияДиссертацияна соискание ученой степеникандидата фармацевтических наукНаучный руководитель:доктор фармацевтических наук, профессорРаменская Галина ВладиславовнаМосква – 20192ОГЛАВЛЕНИЕВВЕДЕНИЕ ....................................................................................................................

3ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .......................................................................... 101.1. Характеристика системы биотрансформации ксенобиотиков ....................... 101.2. Характеристика системы цитохрома Р-450 .....................................................

121.3. Основные методы изучения активности CYP ................................................. 171.4. Методики фенотипирования отдельных изоферментов CYP ........................ 211.5. «Коктейльные» методы фенотипирования изоферментов CYP .................... 26ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .................................................................. 372.1. Физико-химические свойства исследуемых веществ......................................... 372.2. Оборудование ......................................................................................................... 452.3.

Реактивы ................................................................................................................. 462.4. Статистическая обработка .................................................................................... 48ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ...................... 493.1. Выбор внутреннего стандарта .............................................................................. 493.2. Разработка методики количественного определения аналитов в моче ............ 503.2.1.

Отбор проб, пробоподготовка. ................................................................. 503.2.2. Подбор хроматографических условий ....................................................... 523.3. Разработка методики количественного определения аналитов в плазме крови......................................................................................................................................... 553.3.1. Отбор проб, пробоподготовка.

................................................................. 553.3.2. Подбор хроматографических условий ....................................................... 563.4. Валидация разработанных методик количественного определения аналитов вплазме крови и моче .....................................................................................................

593.4.1. Селективность ............................................................................................ 593.4.2. Линейность .................................................................................................. 683.4.3. Эффект матрицы и степень извлечения .................................................. 753.4.4.

Точность и прецизионность ....................................................................... 783.4.5. Нижний рредел количественного определения......................................... 813.4.6. Перенос пробы ............................................................................................. 813.4.7. Стабильность .............................................................................................. 813.5.

Результаты определения активности системы изофермента цитохрома P450 вразличных исследованиях с помощью разработанной методики ............................ 85ОБЩИЕ ВЫВОДЫ................................................................................................... 102СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ ........................................... 1053ВВЕДЕНИЕАктуальность темы исследованияОдной из проблем современной медицины является возникновениенежелательных лекарственных явлений при приёме лекарственных средств. Ктаким явлениям относятся как прогнозируемые нежелательные лекарственныереакции (передозировка, побочные эффекты, связанные со свойствами ЛС), так инепрогнозируемые (непереносимость, аллергические и псевдоаллергическиереакции).

Нередко фармакокинетические параметры одного и того же препаратаварьируют у различных пациентов даже одной этнической группы. Зачастуюнаибольший вклад в риск возникновения данных явлений вносит измененнаяактивность ферментов метаболизма. Одной из основных систем ферментов,отвечающих за метаболизм как эндогенных, так и экзогенных веществ, являетсясистема цитохрома P450 (CYP), учавствующая в метаболизме практически всехлекарственных веществ. CYP включает в себя множество изоферментов, каждыйиз которых обладает собственной функцией в процессе метаболизма икатализирует определённые химические реакции превращения различныхфункциональных групп тех или иных ксенобиотиков и эндогенных веществ.

Наданный момент выделено более 1000 изоферментов CYP, объединенных всемейства и подсемейства. Несмотря на большое количество изоферментов, естьопределенные изоферменты CYP, вносящие наибольший вклад в процессыбиотрансформации по сравнению с другими изоферментами. Таковымиявляются изоферменты CYP1A2, CYP2C9, CYP3A4 и CYP2D6. На их долюсуммарно приходится около 80% известных лекарственных веществ. Помимобиотрансформации ксенобиотиков, данные изоферменты активно участвуют вметаболизмеразличныхэндогенныхсоединений(глюкокортикоиды,холестерин).

Существует несколько подходов к определению активностиизоферментов CYP, одним из которых является метод фенотипирования,заключающийсявопределенииактивностиферментапозначению4«метаболического отношения» - отношения концентрации метаболита кконцентрации субстрата в биожидкостях организма. На данный моментразработанобольшоеколичествометодикопределенияактивностииндивидуальных изоферментов CYP. В последнее время, в связи с появлениемтаких высокочувствительных и селективных методов, как высокоэффективнаяжидкостнаяхроматографиястандемныммасс-спектрометрическимдетектированием (ВЭЖХ-МС/МС), набирают популярность «коктейльные»методы фенотипирования, позволяющие определить активность несколькихизоферментов в одной пробе.Степень разработанности темы исследованияВ настоящее время в литературе описано несколько «коктейльных»методов определения активности различных изоферментов CYP, однако все ониимеют ряд недостатков.

Так, многие предложенные методы подразумеваютиспользованиелекарственныхвеществ-маркеров,являющихсясильнодействующими веществами, либо способными вызвать нежелательныелекарственные реакции (хлорзоксазон у Bing Zhu et al., декстраметорфан уKyung-Suk Oh et al., варфарин у S. Chainuvati). Ни в одном из описанных«коктейльных» методов не используются эндогенные субстраты, в то время каких использование может уменьшить риск возникновения побочных эффектов,тем самым повысив универсальность и безопасность метода. Методикипробоподготовки зачастую включают в себя параллельную многократнуюжидкостную экстракцию как из плазмы крови, так и из мочи, что значительноснижаетвозможностьиспользованиятакихметодоввповседневнойлабораторной практике для определения активности метаболизма.

Более того,некоторые авторы предлагают использование нескольких видов детекторов дляколичественного определения субстратов-маркеров и их метаболитов враздельных пробах, что также затрудняет введение подобных методов впрактику фармакокинетических лабораторий.5Цель исследованияЦелью настоящего исследования является разработка и валидация методикколичественного определения субстратов-маркеров основных изоферментов CYPи их метаболитов при совместном присутствии в биожидкостях организма(плазма крови и моча) методом ВЭЖХ-МС/МС для определения их активности,используя при этом в качестве субстратов лекарственные вещества с низкимриском возникновения нежелательных лекарственных реакций, либо, где этовозможно, эндогенные субстраты.Задачи исследования:1.Провести анализ описанных в литературе методик определенияактивности изоферментов цитохрома P450 методом фенотипирования in vivo, наосновании изученных данных выбрать основные изоферменты для изучения и ихсубстраты-маркерыссоответствующимиметаболитамидляопределенияобразцовисследуемыхактивности выбранных изоферментов.2.Разработатьметодикипробоподготовкибиожидкостей (плазмы крови и мочи) для совместного изолирования аналитов.3.Оптимизироватьхроматографическиеколичественногоопределенияисследуемыхлозартан/E-3174,кортизол/6-β-гидроксикортизол,условиявеществдлясовместного(кофеин/параксантин,пинолин/6-гидрокси-1,2,3,4,-тетрагидро-β-карболин) в плазме крови и моче.4.Провестивалидациюразработанныхметодикколичественногоопределения исследуемых веществ в плазме крови и моче.5.Оценитьвозможностьиспользованияразработанныхметодикопределения активности основных изоферментов CYP (CYP1A2, CYP3A4,CYP2C9, CYP2D6) в практике фармакокинетических лабораторий.6Научная новизнаРазработаны условия пробоподготовки биообъектов для дальнейшегосовместного определения активности CYP1A2, CYP3A4, CYP2C9, CYP2D6при совместном присутствии их специфических субстратов и метаболитов.