Диссертация (Роль вторичного гиперпаратиреоза в формировании иммунного статуса и коррекция его изменений амлодипином при хронической почечной недостаточности (клинико-экспериментальное исследование)), страница 9

Эксперименты в условиях in vitroДля экспериментов in vitro использованацельная кровь 30 клиническиздоровых людей – добровольцев. Характеристика экспериментов в условиях invitro представлена в табл. 2.Для выделения чистой фракции нейтрофилов 2 мл крови смешивали с 3 млстерильного физиологического раствора (0,9 % раствор натрия хлористого), смесьнаслаивали на градиент плотности стерильных растворов фиколла («Pharmacia»,Швеция) и верографина («Spofa», Чехия), плотность верхнего слоя 1,075-1,077г/см3, нижнего – 1,093-1,095 г/см3 и центрифугировали 40 мин при 1500 оборотахвминуту.Кольцонейтрофиловсобирали,переносиливстерильныецентрифужные пробирки, отмывали стерильным раствором Хенкса путёмцентрифугирования при 1500 оборотах в минуту дважды по 7 минут, после чегодоводили до концентрации 5·106 клеток/мл и использовали для оценкифункционального статуса нейтрофилов.Для выделения мононуклеарных клеток кровь наслаивали на градиентфиколл-верографин(«ДНК-технология»,Россия,плотность1,077),центрифугировали в течение 45 мин.

После центрифугирования аккуратноснимали верхний слой плазмы, забиралислой лимфоцитов, лимфоцитытрехкратно отмывали в среде 199 центрифугированием при 1000 об/мин в течение10 мин. Концентрацию лимфоцитов в суспензии доводили до 3·106/л.51Жизнеспособность нейтрофилов и лимфоцитов, рассчитанная в тесте с 0,1%раствором трипанового синего, составила 98%.Таблица 2 - Характеристика экспериментов в условиях in vitroЦель эксперимента Условия экспериментаИсследоватьОценка результатовК 100 мкл суспензии нейтрофилов Поглотительнаявлияние ПТГ на добавляется 100 мкл паратгормона способностьифункциональнуюв разведениях: 0 г/мл; 50·10-9 г/мл; кислород-зависимыйактивность500·10-9 г/мл и 5000·10-9 г/мл.

30 метаболизмнейтрофиловмининкубациивусловиях нейтрофилов.термостата при 37оС.ИсследоватьК 100 мкл суспензии лимфоцитовОпределение в средевлияние ПТГ на добавляется 100 мкл паратгормонаконцентрацийсекреторнуюв разведениях: 0 г/мл; 50·10-9 г/мл;интерлейкина-2,способность500·10-9 г/мл и 5000·10-9 г/мл.интерлейкина -4,лимфоцитовИнкубация в среде RPMI cинтерлейкина -6,гентамицином и телячьейинтерлейкина -8,эмбриональной сывороткой винтерлейкина -10.течение 48 часов при 37оС вбескислородной атмосфере (СО2инкубатор)ИсследоватьК 100 мкл суспензии лимфоцитовГибель лимфоцитоввлияние ПТГ надобавляется 100 мкл паратгормонапутем апоптоза игибельв разведениях: 0 г/мл; 50·10-9 г/мл;некроза.лимфоцитов500·10-9 г/мл и 5000·10-9 г/мл.

30периферическоймин инкубации в условияхкровитермостата при 37оС.При проведении экспериментов использован рекомбинантный человеческийпаратиреоидный гормон в составе препарата «Форстео» (международноенепатентованноеназвание:терипаратид,«ЛиллиФранс»,Франция)в52концентрациях 0 г/мл; 50·10-9 г/мл; 500·10-9 г/мл и 5000·10-9 г/мл, чтосоответствует 0%, 100%, 1000%, 10000% от его нормальной концентрации всыворотке.

У больных ХПН, находящихся на лечении гемодиализом, ссопутствующим вторичным гиперпаратиреозом концентрация ПТГ в кровисоставляет от 150·10-9 г/мл до 5000·10-9 г/мл и более.2.3. Методы исследования2.3.1. Иммунологические методы исследования2.3.1.1. Исследование врожденного иммунитетаОпределение количества лейкоцитов и лейкоцитарной формулы.Количество лейкоцитов в периферической крови определяли общепринятымметодом в камере Горяева. Лейкоцитарную формулу подсчитывали в мазкахкрови, фиксированных метиловым спиртом и окрашенных азур II-эозином поРомановскому-Гимзе.Подсчитывали200лейкоцитов сдифференциациейэозинофилов, базофилов, метамиелоцитов, палочкоядерных и сегментоядерныхнейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов. Их количество выражали в относительных(%) и в абсолютных (·109/л) величинах.Исследование поглотительной способности фагоцитов периферическойкрови проводили на модели поглощения частиц латекса.

Для оценки фагоцитоза200 мкл крови смешивали с 20 мкл взвеси частиц монодисперсного (диаметр 1,7мкм) полистирольного латекса. После 60 минут инкубации при температуре 370Сиз суспензии готовили препараты, которые высушивали, фиксировали метаноломиокрашивалиазурII-эозиномпоРомановскому-Гимзе.Спомощьюиммерсионной микроскопии учитывали активность фагоцитоза – % клеток,захвативших хотя бы одну частицу латекса, интенсивность фагоцитоза – числопоглощенных микросфер латекса в 100 подсчитанных клетках и фагоцитарноечисло – число поглощенных микросфер латекса на один фагоцит.Кислород-зависимый метаболизм фагоцитов оценивали в НСТ-тесте пометоду Маянского А.Н., Виксмана М.Е.

[20]. Метод основан на восстановлении53фагоцитами НСТ в его нерастворимую форму диформазан. Проводилиспонтанный и индуцированный НСТ-тест.В пробирки с 0,2 мл крови добавляли 0,1 мл 0,2% раствора стандартноразведенного нитросинего тетразолия в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4). Дляоценки индуцированного НСТ-теста в каждую пробирку добавляли 20 мклсуспензии частиц монодисперсного (диаметр 1,7 мкм) полистирольного латекса(индуцированная серия) или 20 мкл 0,9% NaCl (спонтанная серия).

После 30минутной инкубации при температуре 370С к реакционной смеси добавляли 3 мл0,1 % соляной кислоты для остановки реакции. Пробирки центрифугировали при1000 об./мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливали, из осадкаготовили мазки. После сушки препараты фиксировали метанолом и окрашивали0,1% водным раствором сафранина. С помощью иммерсионной микроскопииопределяли активность НСТ-теста - % клеток, восстанавливающих НСТ, иинтенсивность НСТ-теста, для чего НСТ-позитивные клетки делили на 3 группы:1 – клетки с единичными гранулами диформазана в цитоплазме (+);2 – клетки с цитоплазмой, наполовину заполненной гранулами диформазана(++);3 - клетки с цитоплазмой, полностью заполненной диформазаном (+++).Для получения коэффициента интенсивности реакции количество клеток в первойгруппе умножали на 1, второй – на 2, в третьей – на 3, результаты суммировали иделили на 100. Конечный результат выражали в у.е.Параллельно с помощью НСТ-теста определяли способность нейтрофиловкрови отвечать повышением метаболической активности на стимуляциючастицами латекса – индуцированный НСТ-тест.Определение лизосомальной активности нейтрофилов по методу И.С.Фрейдлин [31].

Окрашивание нейтрофилов проводили в суспензии клеток. 0,2 млклеточной взвеси в физиологическом растворе NaCl смешивали с 0,02 млраствора акридинового оранжевого в концентрации 2 мкг/мл. Проводилиинкубацию в течении 30 минут при температуре 370 С. После чего каплю взвесипомещали на предметное стекло, исследование в потоке синего фиолетового света54люминесцентногомикроскопа.Подсчетлизосомпроизводилиполуколичественно. При заполнении гранулами лизосом всей цитоплазмы клетоки их количество оценивали тремя крестами (+++).

При заполнении лизосомынаполовину клетки, то определяли двумя крестами (++). Наличие в цитоплазмеединичных лизосом оценивали одним крестом (+). «Нулевой» считалась клетка сотсутствием флюоресцирующих гранул в цитоплазме. Проводили подсчетиндекса суммарной люминисценсции лизосом по формуле: Ах1 + Вх3 + Сх10 +Dх0, где А, В, С, D – количество клеток с заполеннием цитоплазмылизосомальными гранулами или с их отсутствием. Результат выражали вусловных единицах.Определение уровня компонентов комплемента С3, С5 в сывороткекрови человека Определение концентраций С3 и С5 компонентов комплемента всыворотке крови проводили с помощью диагностических наборов «ИФА-С3» и«ИФА-С5» ООО «Хема» (Россия) В данных наборах использован «сэндвич» вариант твердофазного иммуноферментного анализа.

Оптическая плотностькаждой лунки планшета измерялась на автоматическом ИФА-анализаторе«Personal LAB» (Италия) при длине волны 450 нм. Учет результатов производилипо данным стандартной калибровочной кривой.2.3.1.2. Исследование адаптивного иммунитетаОпределениепопуляционногоисубпопуляционногоспектралимфоцитов в крови человека проводили с помощью иммунофенотипированияметодом непрямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональныхантител (МКА) серии ICO производства НИИ «Препарат» (Россия). Проводилитипирование зрелых Т-лимфоцитов (СD3+) и их основных популяций СD4+,СD8+, В-лимфоцитов (СD22+), естественных киллеров, NK-клеток (СD16+),маркера ранней активации лимфоцитов (CD25+), клеток с рецептором ктрансферрину (CD71+), клеток с рецептором готовности к апоптозу APO-1/Fas(CD95+), клеток с HLA-DR+.5550 мкл клеточной суспензии лимфоцитов вносили во все лунки планшета,соответствующие необходимой панели МКА, и две лунки для контроля; клеткиосаждали центрифугированием при 700g в течение 5 минут, удаляли супернатант,добавляли к осадку соответствующие МКА в рабочем разведении.

Затем осадокресуспендировали и инкубировали при комнатной температуре в течение 30минут; трехкратно отмывали средой 199 центрифугированием при 700g в течение5минут;добавляликосажденнымиотмытымклеткам,меченыелюминесцентным красителем (ФИТЦ) Fab-2 фрагменты кроличьих антителпротив иммуноглобулинов мыши (МКА) в рабочем титре в количестве 20 мкл иинкубировали в течение 20 минут при температуре +40С. После трехкратногоотмывания взвеси клеток средой 199 на центрифуге при 700g в течение 5 минутпереносили в лунки ранее приготовленный трафарет из парафиновой пленки по25 мкл ресуспендированной клеточной взвеси из лунок; фиксировали клеткипутем инкубации в формалиновой камере 30 минут. Учет светящихся клетокпроводили в микроскопе «ЛЮМАМ-АИ1» (Россия) при увеличении объектива х90 и окулярах 2,5 (фильтр возбуждения 495 нм, эмиссии - 525 нм).Подсчитывали не менее 200 клеток, результат выражали в % CD-позитивныхклеток (за вычетом % светящихся клеток в лунке отрицательного контроля), споследующим пересчетом в абсолютные показатели (на единицу числалимфоцитов периферической крови).Определение популяционного спектра лимфоцитов в крови крысопределяли методом прямого иммунофлуоресцентного окрашивания клетокцельной крови с использованием специфических крысиных моноклональныхантител фирмы «eBioscience» (США).

Проводили типирование по маркёрамCD45RA (клон ОХ-33) – экспрессируется преимущественно на В-лимфоцитах, атакже на моноцитах, наивных Т-клетках; и CD3 (клон 1F4) – экспрессируется наТ-лимфоцитах.Анализокрашенныхклетокпроводилинапроточномцитофлуориметре «Navios» («Beckman Coulter», США).Определение уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови человекапроводилииммуноферментнымметодомсприменениемтест-систем56производства фирмы «Вектор-Бест» (Россия). Концентрацию Ig A, Ig M, Ig Gопределяли на автоматическом иммуноферментном анализаторе «Personal LAB»(Италия).