Диссертация (Роль вторичного гиперпаратиреоза в формировании иммунного статуса и коррекция его изменений амлодипином при хронической почечной недостаточности (клинико-экспериментальное исследование)), страница 8

Показано, что у больных ХПН, находящихся на гемодиализе,полностью восстанавливается нарушенная пролиферация Т-лимфоцитов послепаратиреоидэктомии [311]. Tzanno-Martins C. et al. сообщают о полномвосстановлении пролиферативной активности лимфоцитов у больных ХПН,находящихся на гемодиализе, через 4 месяца после паратиреоидэктомии [311].Паратиреоидэктомия при экспериментальной ХПН у крыс восстанавливаетспособность В-лимфоцитов к индуцированной ФГА продукции антител [139].Принимая во внимание увеличение внутриклеточной концентрации кальцияв иммунокомпетентных клетках как одного из факторов их дисфункции при ХПН,патогенетически обоснованным для коррекции врожденного и адаптивногоиммунитета при ХПН может быть применение блокаторов кальциевых каналов.Так, применение блокаторов кальциевых каналов у больных с ХПН, находящихсяна гемодиализе, приводит к восстановлению концентрации АТФ и частичномувосстановлению функциональной активности фагоцитов в периферической крови[41].

По другим данным, верапамил, применяемый 8-9 недель у больных стерминальной ХПН в дозе 120 мг/кг, нифедипин, амлодипин и др. блокаторыкальциевых каналов нормализуют содержание кальция, АТФ и углеводов вцитоплазме, но только частично восстанавливает функцию фагоцитов [104, 109,167, 272].42Таким образом, для больных с ХПН характерно развитие вторичнойиммунной дисфункции с заинтересованностью факторов врожденного иадаптивного иммунитета. Активация эффекторов врожденного иммунитета,подавление факторов адаптивного иммунитета, цитокиновый дисбаланс в кровиприводят у больных с ХПН к высокому риску развития инфекционной патологии,атеросклероз-обусловленныхкардиоваскулярныхицереброваскулярныхзаболеваний, злокачественных опухолей и неадекватному ответу на вакцинацию.Патогенез изменений иммунного статуса многогранен и включает эффектыазотемии и продуктов метаболизма, накапливающихся в крови, изменениеметаболизма железа, активности регуляторных систем – симпатоадреналовой,ренин-ангиотен-альдостероновой, нарушения кислотно-основного статуса иводно-электролитного баланса и др.

факторы. Ключевыми патогенетическимифакторамиизмененияиммунногостатусаприХПНмогутвыступатьгиперпаратиреоз, эффекты ПТГ и сопутствующие изменения кальциевофосфорного гомеостаза.Патогенез вторичного гиперпаратиреоза при ХПН является результатомизменения концентрации в сыворотке ионизированного кальция, неорганическогофосфора, кальцитриола (1,25(OH)2-витамин D), фактора роста фибробластов-23(FGF-23). За последние 10 лет внимание многих исследователей сосредоточено наплейотропных эффектах ПТГ, не связанных с гомеостазом кальция и фосфора:регуляцией гемопоэза, углеводного и липидного обмена, сосудистого тонуса всвязисналичиемнаповерхностиклетокспецифическихрецепторов,ответственных за изменение внутриклеточных метаболических процессов иактивностинекоторыхгенов.ОбнаружениерецепторовдляПТГнаиммунокомпетеных клетках предполагает иммунотропные эффекты ПТГ и егоучастие в патогенезе изменений иммунного статуса у больных ХПН.

Сведения овлиянии ПТГ на состояние количественный состав, функциональную активностьразличных популяций Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, антигенпрезентирующихклеток и реализацию Т-лимфоцит-заисимых и В-лимфоцит-зависимых иммунныхреакцийотличаютсякрайнейпротиворечивостью,неоднозначностью.43Противоречивостьрезультатовможетбытьобусловленаособенностямирегистрации эффектов ПТГ, экспериментальными условиями. В частности,использованием цельной крови или выделенных лейкоцитов человека иразличных животных (крыса, мышь, бык), клеточных линий в интактныхусловиях или при различной патологии (ХПН, гиперпаратиреоз первичный,вторичный), временем контакта ПТГ с клетками в условиях in vitro илипродолжительностью экспериментального гиперпаратиреоза in vivo, дозой ПТГ.44Глава 2Материалы и методы исследованияДля изучения роли гиперпаратиреоза и сопутствующих нарушенийфосфорно-кальциевого гомеостаза в формировании иммунного статуса прихронической почечной недостаточности были проведены исследования вклинических и в экспериментальных условиях:1) клинический фрагмент работы выполнен на больных, получающихзаместительную почечную терапию программным гемодиализом в ГБУЗ«Челябинская областная клиническая больница», а также на клинически здоровыхлюдях - добровольцах в период с апреля 2012 года по март 2013 года2) экспериментальная часть исследований выполнена на лабораторныхживотных – белых нелинейных крысах (эксперименты in vivо) и на цельной кровиздоровых людей и больных с ХПН, находящихся на гемодиализе (экспериментыin vitro).2.1.

Общая характеристика исследуемых клинических группПроведенократкосрочное,трехмесячное,открытое,проспективноеисследование иммунного статуса у больных с ХПН, находящихся на лечениипрограммным гемодиализом. План исследования соответствовал положениямХельсинскойдекларацииВсемирноймедицинскойассоциации(ВМА)последнего пересмотра (Токио, 2010), с учетом примечаний к параграфу 29,внесенного генеральной Ассамблеей ВМА (Вашингтон, 2002) и был одобренэтическимкомитетомГБОУВПОЮжно-Уральскийгосударственныймедицинский университет Минздрава России (протокол № 11 от 25.11.2012 г.

и №1 от 22.01.2016 г.).45Для формирования основных групп (группы II-III) обследовано 150 больныхс терминальной стадией ХПН, пациентов отделения диализа ГБУЗ Челябинскаяобластная клиническая больница. Критерии исключения: 1) больные послетрансплантации почки; 2) наличие на момент исследования гнойно-септическихосложнений; 3) наличие у больных увеличенных лимфатических узлов любойлокализации;4)больные,принимающиеглюкокортикостероиднуюи/илицитостатическую терапию; 5) злокачественные и доброкачественные опухолилюбой локализации; 6) ВИЧ-инфекция, гепатит С, гепатит В; 7) аутоиммунныеи/или аллергические заболевания. После рандомизации в исследование включено45 человек, в т.ч.

25 женщины и 20 мужчин, в возрасте от 24 до 79 лет (среднийвозраст53,98±1,55лет).Отвсехбольныхполученописьменноеинформированное согласие для участия в исследовании. Дизайн клиническогофрагмента работы представлен на рисунке 1. Группа I – контрольная (n=24)представлена здоровыми людьми – добровольцами, не имеющими соматическойпатологии и сопоставимыми по возрасту и полу с основными группами. В группеII исследования проводились до процедуры гемодиализа, в группе III – послепроцедуры гемодиализа. Всем больным ХПН 3 раза в неделю проводилосьлечениегемодиализом.Дляпроведениягемодиализаиспользовалисьвысокопоточные капиллярные диализаторы с синтетической мембраной «Elisio190H» («Nipro», Япония), площадью 1,9 м2, коэффициент ультрафильтрации 76мл/час · мм.рт.ст., клиренс: мочевины 199 мл/мин, креатинина 197 мл/мин,фосфатов 183 мл/мин, цианокобаломина 162 мл/мин.

Скорость кровотока – 300мл/мин. Количество сеансов гемодиализа у обследуемых больных составило от 89до 1008, в среднем 371,18±42,42 сеансов. Величина диализной дозы Kt/Vсоставила в среднем 1,44±0,03 мл/мин. Кровь для исследований набирали изартериального колена артерио-венозной фистулы до и после сеанса гемодиализа впробирки «Вакуэт» (Австрия).46группа I - здоровые люди – добровольцы (n=24)I этап:формированиегруппосновные группы:группа II - больные ХПН до процедурыгемодиализа (n=45);группа III - больные ХПН после процедурыгемодиализа (n=45);II этап:обследованиепациентовметоды:III этап:статистическаяобработкарезультатовIV этап:заключительный--иммунологические;биохимические;статистическиеопределение характера распределения иравенства дисперсий признаков в группах;оценка значимости изменений признаков;анализ связи между признаками;обсуждение результатов, формулировкавыводов и положенийРис.

1. Дизайн клинического фрагмента работы.2.2. Экспериментальная часть исследований2.2.1. Эксперименты в условиях in vivoЭксперименты in vivo выполнены на 283 белых нелинейных крысах-самцахмассой 200-220 г., находящихся в стандартных условиях вивария на типовомрационе в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночныхживотных, используемых для экспериментов или в иных научных целях(ETSIN 123, 18 марта 1986 г.), включая приложение А от 15.06.2006 г., cДирективой 2010/63/EU Европейского парламента и совета европейского союзапо охране животных, используемых в научных целях от 22.09.2010 г.Модель хронической почечной недостаточности.

Моделирование ХПН укрыс создавали путем двухэтапной оперативной резекции 5/6 почечной ткани по47методу Шуркалина Б.К. и соавт. в модификации Santos L.S. et al. и Hai-Chun Yanget al [34, 269, 337]. В условиях масочного эфирного наркоза, спонтанного дыханиякрысу размещали на операционном столике с подогревом в положении на спине сфиксацией конечностей. Выстригали шерсть в области операционного поля(передняя брюшная стенка), поле обрабатывали антисептиком «Соната-Септ»(ООО «Уралхимфарм-плюс», Россия), после чего выполняли срединнуюлапаротомию с рассечением кожи, подкожной жировой клетчатки и мышц. Длинаразреза составляла в среднем 3,5 см.I этап моделирования ХПН - правосторонняя нефрэктомия.

Послепроведения лапаротомии в брюшную полость вводили 2-3 салфетки, смоченныеводным раствором 0,05% хлоргексидина с целью ограничения операционногополя от окружающих тканей. Дном операционной раны являлась правая почка,стенками - боковая стенка брюшной полости и тампоны.

Затем рассекалипеченочно-почечнуюсвязку,вскрывалипредпочечнуюфасцию,почкувывихивали на почечной ножке в вентральном направлении, вокруг почечнойножки накладывали и затягивали лигатуру из шелка № 3. Наложение лигатурыповторяли с целью предотвращения её случайного соскальзывания. После этогопроводили отсечение почки дистальнее наложенных лигатур.

Проводиликонтроль гемостаза, извлекали тампоны из брюшной полости, послойно ушивалиоперационную рану. В послеоперационном периоде животных содержали водиночных клетках с максимальным соблюдением требований асептики иантисептики.II этап моделирования ХПН проводили на 7 сутки. Осуществлялиповторнуюлапаротомию,рассекалипредпочечнуюфасцию,послечегопроводили коагуляцию 80% поверхности единственной почки электроножом«ЭХВЧ 200-1» («Политом–1», Россия). ХПН развивалась на 21 суткиэксперимента. Для верификации ХПН определяли концентрацию в сывороткекреатинина, мочевины, мочевой кислоты.Для исследования иммунного статуса при экспериментальной ХПН 128белых нелинейных крыс были случайным образом разделены на 3 группы.48Группа I – контрольная, ложнооперированные животные (n=44).Группа II – животные с ХПН (n=46).Группа III – животные, которым на фоне ХПН вводили блокатор кальциевыхканалов (n=38)Контрольнойгруппеживотных(группаI)проводиласьсрединнаялапаротомия с рассечением кожи, подкожной жировой клетчатки и мышц споследующим послойным ушиванием операционной раны.Животным III группы, начиная с 21 суток эксперимента, per os ежедневновводили блокатор кальциевых каналов в составе препарата «Амлодипин-Тева»(международное непатентованное название: амлодипин, «Тева», Израиль) в дозе0,25 мг/кг в сутки в течение 7 дней, суммарная доза составила 1,75 мг/кг.Исследования во всех группах проводили на 28 сутки эксперимента.Кровь для исследований забирали путем пункции сердца в области левогожелудочка после торакотомии, под эфирным наркозом в соответствии справилами эвтаназии AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition.Модельэкспериментальногогиперпаратиреоза.Дляизученияиммунного статуса в условиях избытка паратиреоидного гормона с помощьюгиперфосфатной диеты у крыс моделировали гиперпаратиреоз по методуDraper H.H.

et al [111].Повышение концентрации паратиреоидного гормона в крови у крысдостигалось содержанием крыс на гиперфосфатной диете. Крыс ежедневнокормили синтетической гиперфосфатной смесью в течение 120 дней из расчета0,15 грамм смеси на 1 грамм массы животного в сутки. Синтетическаягиперфосфатная смесь, включала 0,6% кальция и 4,2% фосфора. Ее полный составпредставлен в таблице 1.Гиперпаратиреозверифицировалиопределениемконцентрациипаратиреоидного гормона, общего кальция и неорганического фосфора всыворотке крови.49Таблица 1 - Состав синтетической гиперфосфатной смеси для моделированиягиперпаратиреоза.НаименованиеМассовая доля, %Кукурузный крахмал28,1Глюкоза33,1Целлюлоза2Кукурузное масло5Соевый белок12,5Поливитаминная смесь Фармавит Нео для0,5грызуновКарбонат цинка0,017-водный сульфат железа (II)0,01285-водный сульфат меди0,0021-водный сульфат марганца0,015Иодид калия0,0002Хлорид натрия0,23Карбонат натрия0,19Карбонат калия0,361-водный дифосфат кальция3,775-водный ортофосфат магния0,961-водный дифосфат натрия13,25Дляисследованияиммунногостатусаприэкспериментальномгиперпаратиреозе 155 белых нелинейных крыс были случайным образомразделены на 3 группы.Группа I – контрольная, интактные животные (n=71).Группа II – животные с гиперпаратиреозом (n=42).Группа III – животные, которым на фоне гиперпаратиреоза вводили блокаторкальциевых каналов (n=42).50Животным III группы, начиная со 121 дня кормления синтетическойгиперфосфатной смесью, ежедневно, в течение 7 дней, per os вводили блокаторкальциевыхканаловамлодипинв составе препарата «Амлодипин-Тева»(международное непатентованное название: амлодипин, «Тева», Израиль) в дозе0,25 мг/кг в сутки, суммарная доза составила 1,75 мг/кг.Исследования во II и III группах проводили на 128 сутки эксперимента.Кровь для исследований забирали в путем пункции сердца в области левогожелудочка после торакотомии, под эфирным наркозом в соответствии справилами эвтаназии AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition.2.2.2.