Диссертация (Лечение больных инфекциями, передаваемыми половым путём, и нарушениями микробиоценоза влагалища на фоне рубцовой деформации шейки матки), страница 10

Клиническим материалом для ПЦР-диагностики ИПППявлялся соскоб отделяемого цервикального канала.Серологическая диагностика сифилиса производилась с применениемпрямого и непрямого методов – РМП и РПГА соответственно. Клиническимматериалом для серологической диагностики сифилиса служила сывороткакрови.Для лабораторной диагностики бактериального вагиноза выполнялосьмикроскопическое исследование отделяемого влагалища. Оценивалось наличиеиколичестволактобактерий,качественныйиколичественныйсоставвлагалищной микрофлоры, количество лейкоцитов, соотношение лейкоцитов иэпителия, наличие «ключевых» клеток.2.2.2 Методы оценки показателей местного иммунитета шейки маткиОпределение уровней провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНОα) в цервикальной слизи осуществлялось с помощью иммуноферментногоанализа (ИФА), используя иммуноферментные тест-системы «ProCon» (СанктПетербург) и «Amersham Pharmacia Biotech» (Букингемшир, Великобритания).Исследованиесодержанияиммуноглобулиноввслизистойпробке(сывороточные иммуноглобулины классов A, G, M [IgA, IgG, IgM], секреторныйиммуноглобулинA[sIgA])проводилосьметодомтвердофазногоиммуноферментного анализа (т-ИФА) с применением биотинилированныхантител.52Для этого полистироловые 96-ти луночные плоскодонные планшеты(Greiner)сенсибилизировалиаффиноочищеннымиантителамипротивсоответствующих изотопов иммуноглобулинов в дозе 10 мкг/мл на лунку 16часов при 4°С, затем вносили на 1 час при 37° С 100 мкл/мл шеечной слизи вразведении 1:100 для определения иммуноглобулинов.

После отмывки в лункувносили на 1 час при 37°С 100 мл IgG против соответствующих изотиповиммуноглобулинов,конъюгированныеспероксидазойхрена(Sigma).Проявление реакции осуществляли с помощью ортофенилиндиамина, перекисиводорода остановкой реакции 10% раствором серной кислоты. Учет реакциипроводили при длине волны 492 нм на спектрофотометре «Мультискан».Исследования проводились в фазу пролиферации (на 8-10 день) менструальногоцикла, так как показатели иммунитета, и, прежде всего, местного, зависят отуровня половых гормонов.2.2.3 Методы оценки физико-биологических свойств цервикальнойслизиФизико-биологические свойства цервикальной слизи оценивались наоснове цервикального числа (шеечного индекса).

Для исследования забор слизииз слизистой цервикального канала осуществлялся при помощи спиретте(компания ФармаМед, Канада) на 14-16-й день менструального цикла. Шейкаматки обнажалась при помощи гинекологических зеркал. Со слизистойцервикального канала проводили взятие слизи.Шеечный индекс определяли на основе тестов: феномен «папоротника»,«зрачка», симптом натяжения слизи и её количество.

Свойства цервикальнойслизи оценивали по системе Inser (1970): максимальная оценка каждого тестасоставляла 3 балла, минимальная – 0 баллов. Шеечный индекс 0-3 балласвидетельствует о резком нарушении физико-химических свойств цервикальнойслизи, 4-6 баллов – об умеренном, 7-10 баллов – соответствует норме, более 10баллов – об усиленной секреции.53Балльная оценка объёма цервикальной слизи проводилась следующимобразом: 0 баллов – 0 мл, 1 балл – 0,1 мл, 2 балла – 0,2 мл, 3 балла – 0,3 мл и более.Исследованиефеномена«папоротника»основанонаспособностицервикальной слизи давать при высушивании кристаллы. Кристаллизацияоценивалась следующим образом: 0 баллов – отсутствие кристаллизации, 1 балл – атипичная кристаллизация, 2 балла – образование первичных и вторичных стеблей, 3 балла – образование третичных и четвертичных стеблей.Проба цервикальной слизи, нанесенная на предметное стекло ивысушенная в струе воздуха, рассматривалась под микроскопом при 100кратном увеличении.

Типы «листа папоротника» могут быть различными изависят, например, от толщины препарата или от числа клеток, присутствующихв нем. Кроме того, в препарате можно наблюдать сразу несколько этаповфеномена «папоротника». Иногда в одном препарате наблюдаются сразу всеэтапы.Для изучения феномена натяжения слизи цервикальная слизь наносиласьна предметное стекло, затем его осторожно накрывали покровным стеклом,стекла разводили в стороны. Длину нитей слизи между стеклами измеряли всантиметрах и оценивали следующим образом: 0 баллов – длина менее 1 см, 1 балл – длина 1-4 см, 2 балла – длина 5-8 см, 3 балла – длина более 9 см.Анализ симптома «зрачка» основывался на виде цервикальной слизи внаружном зеве канала шейки матки и оценивался соответствующими баллами:54 0 баллов – (-) отрицательный 1 балл – (+) слабо положительный 2 балла – (++) положительный 3 балла – (+++) резко положительный2.2.4 Методы оценки теста пенетрации сперматозоидовИзучениевзаимодействиясперматозоидовсцервикальнойслизьюпроводится с помощью in vitro тестов на проницаемость цервикальной слизи.Тесты подразделяются на три основные группы:тесты на предметном стекле;тесты на контакт спермы с цервикальной слизью;тест в капиллярных трубочках.В своей работе мы использовали методику проведения теста напредметном стекле в соответствии с рекомендациями ВОЗ, сперма бралась уодного предварительно обследованного донора.

Забор слизи для исследованияосуществлялсяна14-16-йденьменструальногоцикла.Длявзятияэндоцервикальных мазков использовали Скринет (компания ФармаМед,Канада).Скринетпозволяетполучитьбогатыйклеткамиихорошосохраняющийся материал.Каплю цервикальной слизи наносили на предметное стекло и покрывалипокровным стеклом (25 × 40 мм). Капли спермы располагали у каждого краяпредметного стекла, соприкасая их с краем покровного стекла. Образующаясятяга заставляет сперму двигаться под покровное стекло.

При этом междуспермой и цервикальной слизью образуется интерфейс.В месте соприкосновения через несколько минут образуются выступы илифаланги, которые проникают в слизь. Большая часть сперматозоидов проходитчерез эти выступы до проникновения в слизь. Во многих случаях одинсперматозоид влечет за собой в цервикальную слизь колонну сперматозоидов.Попадая в цервикальную слизь, сперматозоиды рассеиваются. Некоторые изних возвращаются к слою плазмы семенной жидкости, однако большая часть55продолжает мигрировать в глубь слизи, пока не встретит сопротивленияклеточных остатков или лейкоцитов. В поле зрения микроскопа пересчитываликоличество сперматозоидов, проникших в глубь шеечной слизи.

Сперматозоидыв фалангах в расчет не принимали, учитывали только те сперматозоиды,которые явно проникли в цервикальную слизь. Для количественной оценкитеста через 5 и 15 минут после его начала пересчитывали количествосперматозоидов в первом, ближайшем к интерфейсу, поле зрения микроскопа(F1) (увеличение × 400). Увеличение регистрировали для каждого отдельноготеста. Для определения глубины проникновения изучали второе поле зрения,примыкающее к первому (F1), затем третье (F3). Количество сперматозоидов вэтих полях также регистрировали (рис.

3).Полученные результаты оценивались следующим образом: 0 баллов (отрицательный результат) – ни в F1, ни в F2проникновения сперматозоидов нет, 1 балл (плохой результат) – 5 сперматозоидов в поле зрениямикроскопа F1, 0-1 сперматозоид в поле зрения микроскопа в F2, 2 балла (хороший результат) – 15 сперматозоидов в поле зрениямикроскопа F1, 10 сперматозоидов в поле зрения микроскопа в F2, 3 балла (отличный результат) – более 25 сперматозоидов в полезрения микроскопа F1, более 25 сперматозоидов в поле зрениямикроскопа в F2.56Рис.

3. Схематическое изображение проникновения сперматозоидов вцервикальную слизь in vitro. Тест на предметном стеклеСМ – цервикальная слизьSp – сперматозоидыI - F – интерфейсPh – фалангиF1 – первое поле зрения микроскопаF2 – второе поле зрения микроскопа, смежное с F1572.2.5 Морфологические исследованияДляморфологическогоисследования(насветооптическомиультраструктурном уровнях) ткани шейки матки производилась ножеваябиопсия шейки матки.Кусочки шейки матки размером 1-2 мм фиксировали в течение 2 часов в2,4% растворе глютаральдегида на 0,1 М какодилатном буфере (pH 7,4). Затемотмывали несколько раз в растворе какодилатного буфера (pH 7,4) сдобавлением 0,45 мг сахарозы на 1 мл буфера с последующей дофиксацией в1% растворе OsO4 на том же буфере в течение 1,5 часов при температуре 4°С.Проводили дегидратацию восходящей концентрацией этилового спирта ипропиленоксида.Выполнялизаливкувэпон-аралдитовуюсмесьпообщепринятой методике и полимеризацию полученных блоков при температуре70°C в течение 12 часов.

Из каждого блока готовили полутонкие срезытолщиной 1 мкм с последующей окраской толуидиновым синим, изучали всветовом микроскопе.Препараты использовали также для прицельного выбора для ультратомии.Ультратонкие срезы получали на ультратоме «КВ-8800» и контрастировалицитратомсвинца.Полученныепрепаратыизучалисьнаэлектронноммикроскопе.2.3 Инструментальные методы диагностики2.3.1 Исследование зеркаламиПри осмотре шейки матки с помощью гинекологических зеркалпроводилась оценка её размера, формы, состояния наружного маточного зева,устанавливалось наличие рубцовой деформации, эндоцервицита, бородавок идругих патологических проявлений. Особое внимание уделялось проявлениямрубцовой деформации шейки матки: характеру деформации, величине дефекта(степеньдеформации),состояниюцервикального канала.58вывернутойслизистойоболочки2.3.2 КольпоскопияПроводилась простая и расширенная кольпоскопия.

При проведениирасширенной кольпоскопии применялись стандартные пробы: проба с 3%уксусной кислотой и проба Шиллера с использованием 2% раствора Люголя.Осмотр проводили последовательно, обращая внимание на рельеф и цветслизистой оболочки, на границу многослойного плоского и цилиндрическогоэпителиев, на расположение, форму и калибр субэпителиальных сосудов, чтопозволяло выявить степень патологического процесса и исключить атипиюсосудов.Расширенную кольпоскопию с применением 3% раствора уксуснойкислоты и 2% раствора Люголя проводили для более точного определения всехучастков изменённого эпителия.2.4 Методы леченияТрадиционноприменяемыеметодылеченияИПППинарушениймикробиоценоза влагалища, использовавшиеся в работе, основаны на данныхдоказательноймедицины,представленныхвактуальныхклиническихрекомендациях профессиональных медицинских сообществ: РОДВК [66, 81,86], РОАГ [50], CDC [128, 150], IUSTI [163, 185] и BASHH [129, 151, 152].2.4.1 Методы лечения бактериального вагинозаВ качестве традиционно применяемой терапии бактериального вагинозапациенткам назначался метронидазол 500 мг внутрь 2 раза в сутки в течение 7дней.

Клиническая эффективность метронидазола при бактериальном вагинозеобусловлена воздействием на анаэробную составляющую бактериальнойфлоры. Дляпредотвращенияразвитиядисульфирамоподобных реакцийпациенток предупреждали о необходимости избегать приёма алкоголя в периодтерапии метронидазолом и в течение 24 часов после её окончания.Метронидазол рекомендован в качестве препарата выбора при лечениибактериальноговагинозаРоссийским обществом дерматовенерологов и59косметологов(РОДВК,2013)[66],Российскимобществомакушеров-гинекологов (РОАГ, 2014) [50], Центрами по контролю и профилактикезаболеваний США (CDC, 2010) [128] и Британской ассоциацией сексуальногоздоровья и ВИЧ-инфекции (BASHH, 2012) [151].Пациенткам с бактериальным вагинозом на фоне рубцовой деформациишейки матки, не имевшим противопоказаний для хирургического лечения идавшим письменное информированное согласие на его проведение, в качествепатогенетическойоперации,терапиивыполнялисьвосстанавливающиереконструктивно-пластическиеархитектоникуцервикальногоканалаисоздающие условия для ликвидации хронического воспаления.