Диссертация (Этолого-иммунологическая характеристика экспериментального десинхроноза в условиях искусственного освещения и применения мелатонина), страница 8

Кровь дляисследований забирали в 08.00 часов путем пункции сердца в области левогожелудочка после торакотомии, под эфирным наркозом в соответствии справилами эвтаназии AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition.41Работа проводилась при финансовой поддержке Министерства образованияи науки Российской Федерации (государственный контракт № 14.516.11.0091 от01.07.2013 г).2.2. Эксперименты в условиях in vitroДля экспериментов в условиях in vitro использована цельная кровь 60клинически здоровых людей добровольцев - студентов дневной формы обученияГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздрава России в возрасте от 18 до 22 лет.Характеристика экспериментов в условиях in vitro представлена в таблице 2.Организация исследования одобрена этическим комитетом ГБОУ ВПО ЮУГМУМинздрава России (протоколы № 9 от 09.11.2013 г., № 1 от 22.01.2016).Таблица 2.

- Характеристика экспериментов в условиях in vitroЦель экспериментаИсследоватьУсловия экспериментаОценка результатоввлияние Контроль: нейтрофилы здоровых После 10, 20 и 30 минлюминесцентныхлюдей + действие естественного инкубацииисточников освещения на освещения (10 минут, 20 минут, термостатафункциональную30 минут).активность нейтрофиловОпыт:нейтрофилылюдей+вусловияхпри37оС:поглотительнаяздоровых способностьиНСТ-действие редуцирующая способностьлюминесцентного освещения (10 нейтрофиловминут, 20 минут, 30 минут).Исследоватьвлияние Контроль: нейтрофилы здоровых После 10, 20 и 30 минсветодиодныхлюдей + действие естественного инкубацииисточников освещения на освещения (10 минут, 20 минут, термостатафункциональную30 минут).активность нейтрофиловОпыт:нейтрофилылюдей+вусловияхпри37оС:поглотительнаяздоровых способностьиНСТ-действие редуцирующая способностьлюминесцентного освещения (10 нейтрофиловминут, 20 минут, 30 минут).42Дляисследованиявлияниясвета,генерируемогоискусственнымиисточниками освещения, на функциональную активность нейтрофилов проведенасерия экспериментов, в ходе которых опытные и контрольные пробы,содержащие суспензию нейтрофилов, инкубировали в специально оборудованныхдля проведения эксперимента термостатах при температуре 370С в течение 10, 20и 30 минут.

Световое поле конфигурировали таким образом, чтобы в любой точкевзвеси нейтрофилов отклонение плотности светового потока составляло не более10% от заданного.2.3. Методы исследования2.3.1. Этологические методы исследованияТестоткрытоеполе:проводитсясцельюизученияповеденияэкспериментальных животных в новых (стрессогенных) условиях и позволяетоценить по выраженности и динамике отдельных поведенческих элементов, вопервых, уровень эмоционально-поведенческой реактивности животного, вовторых, стратегию ориентировочно-исследовательского поведения [17, 37, 75].Актограф представляет собой открытую квадратную площадку 80х80 см,ограниченную по периметру непрозрачными бортами.

Дно арены разделено на 16квадратов, в центре каждого квадрата имеется 1 отверстие диаметром 3 см,предназначенноедлявыявлениявидоспецифическогокомпонентаисследовательской активности у грызунов (норковый рефлекс). Исследуемоеживотное помещали в открытое поле в угловой квадрат у стенки арены. Тестпродолжался 30 минут. Каждое животное тестировалось один раз. В ходе тестарегистрировалипоследовательностиповеденческихактов:горизонтальнуюактивность (ГА) - число пересеченных квадратов на дне арены, вертикальнуюактивность (ВА) - число стоек животным на задние лапы с опорой и без опоры наборт арены, исследовательскую активность (ИА) – число заглядываний вотверстия в полу арены, число актов груминга (ГР), количество фекальных43болюсов (ФБ).

Поведенческие акты и вегетативные реакции регистрировали спомощью цифровой видеокамеры «Logitech HD C525» (Китай). Полученныеданныеобрабатывалиматематическисиспользованиемкомпьютернойпрограммы «Real Timer» (ООО «НПК Открытая Наука», Россия). Тест проводилина 9, 19, 29 сутки эксперимента.Водный «лабиринт» Морриса: применяется для исследования у животныхсостояния когнитивной функции, способности к пространственной навигации[321]. Представляет собой бассейн диаметром 180 см и высотой 60 см,заполненный водой. Воду в бассейне окрашивали молоком, для исключениявозможности визуально распознавать подводную платформу. Температура водысоставляла 24±2 Сo. На стенах бассейна закрепляли изображения чёрно-белыхгеометрических фигур для облегчения ориентирования животных в пространстве(круг, квадрат, треугольник, ромб).

Платформу из полупрозрачного оргстекла15x15см помещали в центр северного сектора бассейна (рядом с фигурой ромба),ниже уровня воды на 1 – 2 см. Проводили ряд тестов: тест со скрытойплатформой, тест на зрительное восприятие, тест без платформы. Движенияживотных фиксировали с помощью видеокамеры «Logitech HD C525» (Китай),размещённой над бассейном. В ходе эксперимента выполнено три серии тестов вводном «лабиринте» Морриса: с 4 по 9 сутки эксперимента, с 14 по 19 суткиэксперимента, с 24 по 29 сутки эксперимента. В каждой серии тестов участвовалиразные животные.В тесте со скрытой платформой ежедневно в течение четырех днейживотным давали по 2 попытки для поиска невидимой с поверхности водыплатформы, для чего морскую свинку помещали в воду мордой к стенке в одномиз четырёх секторов бассейна.

Попытка заканчивалась в момент нахожденияживотным платформы или через 90 с, если морская свинка не находилаплатформу. Отдых животного на платформе, независимо от результата теста,продолжался 30 с. Если животное оставалось на платформе менее 15 с, еговозвращали на платформу дважды. В интервале между двумя испытаниямиживотные помещались в клетку на 5 мин. В каждый из четырёх дней меняли44сектор запуска животного в бассейн.

В данном тесте регистрировали среднеевремя поиска скрытой под водой платформы между двумя попытками, среднююдлину траектории достижения поиска скрытой под водой платформы междудвумя попытками. Расчет траектории перемещения животного осуществляли спомощью компьютерной программы «Any-maze» («Stoelting Co.», США).На 5-ый день проводили два теста: тест на зрительное восприятие и тест безплатформы.

В тесте на зрительное восприятие в южный сектор (напротивсеверного, в котором располагалась платформа, скрытая под водой в течениечетырех дней) помещали возвышающуюся на 1,5 см над водой чёрнуюплатформу, а животных запускали в бассейн в северном секторе. Времянахождения платформы не ограничивали.

Регистрировали время нахожденияплатформы.В тесте без платформы животных помещали в южный сектор и платформуубирали.Времяпопыткисоставляло90секунд.Регистрироваливремяпребывания животного в каждом секторе, процент нахождения животного всеверном секторе - в области расположения подводной платформы.2.3.2. Иммунологические методы исследования2.3.2.1. Исследование врожденного иммунитетаКоличестволейкоцитоввпериферическойкровиопределялиобщепринятым методом с подсчетом в камере Горяева.

Лейкоцитарнуюформулу подсчитывали в мазках крови, фиксированных метиловым спиртом иокрашенных азур II-эозином по Романовскому-Гимзе. Подсчитывали 200лейкоцитов с дифференциацией эозинофилов, базофилов, палочкоядерных исегментоядерныхнейтрофилов,лимфоцитов,моноцитов.Ихколичествовыражали в относительных (%) и в абсолютных (•109/л) величинах.Выделение чистой фракции нейтрофилов. Цельную кровь в объеме 10 мл(антикоагулянт гепарин («Гедеон-Рихтер», Венгрия), 50 ЕД/мл) получали45пункцией локтевой вены. Для выделения чистой фракции нейтрофилов 2 мл кровисмешивали с 3 мл стерильного физиологического раствора (0,9 % раствор натрияхлористого), полученную смесь наслаивали на градиент плотности стерильныхрастворов фиколла («Pharmacia», Швеция) и верографина («Spofa», Чехия),плотность верхнего слоя 1,075-1,077 г/см3, нижнего – 1,093-1,095 г/см3 ицентрифугировали 40 мин при 1500 оборотах в минуту [30].

Кольцо нейтрофиловсобирали, переносили в стерильные центрифужные пробирки, отмывали отградиента стерильным раствором Хенкса путём центрифугирования при 1500оборотах в минуту дважды по 7 минут, после чего доводили до концентрации5•106клеток/млииспользовалидляоценкифункциональногостатусанейтрофилов. Жизнеспособность нейтрофилов, рассчитанная в тесте с 0,1%раствором трипанового синего, составила 98%.Дляисследованияпоглотительнойспособностинейтрофиловпериферической крови 200 мкл крови смешивали с 20 мкл взвеси частицмонодисперсного (диаметр 1,7 мкм) полистирольного латекса. После 60 минутинкубации при температуре 370С из суспензии готовили мазки, которыевысушивали, фиксировали метанолом и окрашивали азур II – эозином поРомановскому-Гимзе.