Диссертация (Этолого-иммунологическая характеристика экспериментального десинхроноза в условиях искусственного освещения и применения мелатонина), страница 9

С помощью иммерсионной микроскопии учитывалиактивность фагоцитоза – % клеток, захвативших хотя бы одну частицу латекса,интенсивность фагоцитоза – число поглощенных микросфер латекса в 100подсчитанных клетках (у.е.) и фагоцитарное число – число поглощенныхмикросфер латекса на один нейтрофил (у.е.) [29, 77].НСТ-редуцирующую активность нейтрофилов оценивали по методуМаянского А.Н., Виксмана М.Е. [19]. Метод основан на восстановлениинейтрофилами нитросинего тетразолия (НСТ) в его нерастворимую формудиформазан. Проводили спонтанный и индуцированный НСТ-тест.В пробирки с 0,2 мл крови добавляли 0,1 мл 0,2% раствора стандартноразведенного нитросинего тетразолия в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4).

Дляоценки индуцированного НСТ-теста в каждую пробирку добавляли 20 мклсуспензии частиц монодисперсного (диаметр 1,7 мкм) полистирольного латекса46(индуцированная серия) или 20 мкл 0,9% NaCl (спонтанная серия). После 30минутной инкубации при температуре 370С к реакционной смеси добавляли 3 мл0,1 % соляной кислоты для остановки реакции. Пробирки центрифугировали при1000 об./мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливали, из осадкаготовили мазки.

После сушки препараты фиксировали метанолом и окрашивали0,1% водным раствором сафранина. С помощью иммерсионной микроскопииопределяли активность НСТ-теста - % клеток, восстанавливающих НСТ, иинтенсивность НСТ-теста для чего НСТ-позитивные клетки делили на 3 группы:группа 1 – клетки с единичными гранулами диформазана в цитоплазме (+)группа 2 – клетки с цитоплазмой, наполовину заполненной грануламидиформазана (++)группа 3 – клетки с цитоплазмой, полностью заполненной диформазаном(+++).Для получения коэффициента интенсивности реакции количество клеток вгруппе 1 умножали на 1, в группе 2 – на 2, в группе 3 – на 3, результатысуммировали и делили на 100.Методопределенияактивностилизосомальныхферментовнейтрофилов периферической крови И.С.

Фрейдлин [51].Количество лизосом в цитоплазме нейтрофилов представляет собойпоказатель, отражающий их функциональную активность и способность креагированию на внешние воздействия. Нейтрофилы выделяли из цельной крови,какбылоописановыше.Прижизненноеисследованиеинтенсивностилюминесценции лизосом в цитоплазме нейтрофилов, окрашенных акридиновыморанжевым, является одним из методов оценки состояния лизосомальногоаппарата клеток.

Окрашивание нейтрофилов проводили в суспензии клеток. Дляэтого к 0,2 мл взвеси нейтрофилов в физиологическом растворе (концентрация5.106 клеток/мл) добавляли 0,02 мл раствора акридинового оранжевого вконцентрации 2 мкг/мл и инкубировали 30 мин при 37 0С. После 30-минутнойинкубации каплю суспензированного осадка помещали на предметное стекло,накрывали покровным стеклом и микроскопировали под масляной иммерсией в47потоке сине-фиолетового света люминесцентного микроскопа «МикМед» (г.Санкт-Петербург).Определяли лизосомальную активность – число нейтрофилов, имеющихлизосомальные гранулы (%), также проводили подсчет лизосом в нейтрофилахполуколичественно в «крестах», выделяя 3 группы: группа 1 - клетки, в которыхлизосомы заполняли всю цитоплазму (+++); группа 2 - клетки, в которыхлизосомы занимали ½ поверхности цитоплазмы (++); группа 3 - клетки, сналичием в цитоплазме единичных лизосом (+), группа 4 - нулевая, клетки сотсутствием лизосом в цитоплазмеПроводили подсчет индекса суммарной люминисценсции лизосом поформуле: Ах1 + Вх3 + Сх10 + Dх0, гдеA - количество клеток в группе 1, B - количество клеток в группе 2, C количество клеток в группе 3, D – количество клеток в группе 4.Результат выражали в условных единицах.2.3.2.2.

Исследование адаптивного иммунитетаОценка адаптивного иммунитета у морских свинок. Тh1-зависимыйиммунный ответ исследовали по реакции гиперчувствительности замедленноготипа (ГЗТ) у морских свинок, иммунизированных эритроцитами барана.Интенсивность ГЗТ оценивали по выраженности воспалительного отека стопы, вкоторую вводили эритроциты барана, использовавшиеся для предварительнойиммунизации.Через4сутокпослеиммунизацииморскихсвинокнаркотизировали диэтиловым эфиром и вводили разрешающую дозу эритроцитов(107 клеток на 1 г массы тела) в подошвенную поверхность стопы.Для инъекции использовали отмытые эритроциты барана (1010 клеток/мл),вводили в лапу из расчета 0,1 мл на 100 г массы тела.

В контрольную лапувводили эквиобъёмное количество 0,9% NаCl. Через 24 часа после инъекцииразрешающей дозы эритроцитов барана животных умерщвляли цервикальнойдислокацией, аккуратно рассекали голеностопные суставы и отделяли обе стопы.48Волюмометрическим методом определяли объем обеих стоп.

Интенсивность ГЗТрассчитывали как разность между объемом стопы (в мл), в которую вводилиэритроциты барана, и объемом стопы, в которую вводили 0,9% NаСl.Тh2-зависимыйиммунныйответоценивалипоколичествуантителообразующих клеток (АОК) в селезенке животных, иммунизированныхаллогенными эритроцитами, по A. J.

Cunningham [171]. Морских свинокиммунизировали внутрибрюшинной инъекцией 10% взвеси эритроцитов барана в0,9% NaCl (1 мл суспензии содержит 109 клеток), взвесь вводили в объеме 1 мл на100г массы тела (доза 107 эритроцитов на 1 г массы). Через 5 дней послеиммунизации животных забивали, извлекали и взвешивали селезенку, отделяли оторгана фрагмент массой 30 мг.

Полученную навеску с помощью стеклянногогомогенизатора растирали в среде 199 из расчета 1 мл на 3 мг ткани. Гомогенатфильтровали, добавляли 0,1 мл 10% взвеси аллогенных эритроцитов и 0,1 мл 20%раствора комплемента (1:1:1), перемешивали и заполняли камеры, инкубировали180 мин в термостате (37°С). Использовали камеры из предметных и покровныхстекол, как описано у Волчегорского И.А. и соавт.

[97]. С помощью лупыподсчитывали в камерах число бляшек гемолиза. Абсолютное содержание АОК вселезенке вычисляли по формуле:3 • количество бляшек в чашке • А • С / В • D, где3 – коэффициент разведения гомогената навески при смешивании ссуспензией аллогенных эритроцитов и раствором комплемента, А - массаселезенки, В - масса навески органа, С – объем гомогената навески, D – объемкамеры.Затем производили перерасчет на ядросодержащие клетки (106 ЯСК)селезенки.492.3.2.3. Определение концентрации некоторых цитокинов и гормонов впериферической кровиНа автоматическом иммуноферментном анализаторе «Personal LAB»(Италия) определяли в периферической крови концентрацию интерлейкина - 4(ИЛ-4), интерферона-гамма (ИФН-γ) с помощью специфичных для морскихсвиноктест-системпроизводителя«Uscn.LifeScienceInc.»(Китай),концентрацию мелатонина, кортизола – с помощью специфичных для морскихсвинок тест-систем производителя «Сusabio» (Китай). Уровень ИЛ-4 и ИФН-γвыражали в пг/мл, уровень мелатонина, кортизола - в нг/мл.2.4.

Статистические методы исследованияСтатистическую обработку результатов проводили с использованиемпакета прикладных программ «Statistica v. 10.0 for Windows». Характеристикавыборок представлена в формате «М±m», где М-среднее арифметическоезначение признака, m-стандартная ошибка среднего. Проверку статистическихгипотез в группах проводили с использованием непараметрических критериев (U– Манна-Уитни, WW – Вальда-Вольфовитца, Крускала-Уоллиса). Для выявлениясвязи между изучаемыми параметрами использовали коэффициент корреляцииСпирмена (R). Отличия считали статистически значимыми при р≤0,05.50Глава 3Результаты собственных исследований и их обсуждение3.1.

Этологический и иммунный статус организма при экспериментальномдесинхронозе в условиях искусственного освещения3.1.1. Этологический и иммунный статус организма при десинхронозе вусловиях люминесцентного освещения3.1.1.1. Этологический статус при десинхронозе в условиях люминесцентногоосвещенияДля изучения поведенческой активности животных были использованы дваметодических подхода: тест «открытое поле» и водный «лабиринт» Морриса.Тест«открытоеполе»проводитсясцельюизученияповеденияэкспериментальных животных в новых (стрессогенных) условиях и позволяетоценить уровень эмоционально-поведенческой реактивности животного по числуфекальных болюсов, уринаций, груминговой активности, времени выхода изцентра и времени замирания; стратегию ориентировочно-исследовательскогоповедения по горизонтальной и вертикальной двигательной активности, времениреакции обнюхивания [17, 37, 47, 75, 369].Водный «лабиринт» Морриса применяется для исследования у животныхпространственной памяти и способности к обучению, отражающих когнитивнуюфункцию животных [321].

В данной методике проводится ряд тестов: тест соскрытой платформой, тест на зрительное восприятие, тест без платформы.При проведении теста «открытое поле» на 10 сутки отмечается снижениеисследовательской активности животных, повышение числа актов груминга иколичествафекальныхболюсовпосравнениюсозначениямигруппыстандартного фиксированного люминесцентного освещения (таблица 3). На 2051сутки наблюдается повышение горизонтальной активности в сочетании сподавлениемфекальныхисследовательскойболюсов.горизонтальнойиНа30активностисуткииповышениемживотные демонстрируютисследовательскойактивности,приэтомколичестваснижениеотмечаетсяповышение количества фекальных болюсов.Таблица 3 - Показатели теста «открытое поле» при десинхронозе в условияхлюминесцентного освещения (М±m)ПоказателиГА,10 сутки20 сутки30 суткиГруппа 2Группа 4Группа 2Группа 4Группа 2Группа 4СФЛОДЕСЛОСФЛОДЕСЛОСФЛОДЕСЛО(n=6)(n=6)(n=8)(n=8)(n=6)(n=8)29,67±2,7930,67±3,9023,00±3,1150,75±5,8029,33±4,1519,50±2,96количество*#*#&актовВА,2,67±0,212,00±0,371,67±0,421,50±0,192,00±0,372,25±0,495,00±0,972,33±0,212,67±0,211,25±0,163,33±0,211,50±0,19количествоактовИА,количество**#*#актовГР,1,67±0,42количество3,33±0,211,33±0,211,75±0,312,67±0,762,00±0,465,33±0,768,00±1,284,33±0,428,25±0,86*актовФБ,количество5,00±1,327,83±1,08***актовПримечание.

* – значимые (р<0,05) различия с группой СФЛО; # – значимые (р<0,05)различия с 10 сутками в группе ДЕСЛО; & - значимые (р<0,05) различия с 20 сутками вгруппе ДЕСЛО. ГА – горизонтальная активность, ВА – вертикальная активность, ИА –исследовательская активность, ГР – груминг, ФБ - фекальные болюсы52Таким образом, исследовательская активность снижается на 10 сутки, 20сутки и 30 сутки, горизонтальная активность повышается на 20 сутки и снижаетсяна 30 сутки наблюдения, вертикальная активность значимо не изменяется во всесроки наблюдения; количество фекальных болюсов увеличивается на 10 сутки, 20сутки и 30 сутки, количество актов груминга увеличивается только на 10 суткиэксперимента. При оценке показателей этологического статуса в динамике 10-30суток десинхроноза отмечено снижение исследовательской активности игруминга на 20 сутки и 30 сутки по сравнению с 10 сутками.